【摘要】：研究背景結(jié)腸癌是一種常見的消化道腫瘤,在我國發(fā)病率逐年上升。近20年來,盡管手術(shù)和化療方式有了很大進步,但患者總體生存率并無顯著提高。因此,探索結(jié)腸癌發(fā)生和發(fā)展新機制,尋找新的臨床干預思路和策略顯得尤為重要。硼替佐米(Bortezomib, PS-341)是全球第一個合成的26S蛋白酶體抑制劑。體外試驗證明硼替佐米對多種類型的癌細胞具有細胞毒性。由于臨床研究證實硼替佐米對多發(fā)性骨髓瘤和套細胞淋巴瘤的療效反應,因此美國食品藥品監(jiān)督管理局通過準許其用于這類病人。目前,在包括結(jié)腸癌在內(nèi)的實體瘤研究正在逐步開展,但臨床研究發(fā)現(xiàn)單用硼替佐米在實體瘤中的作用有限,可能與化療抵抗或其他機制有關(guān)。因此,硼替佐米的化療增敏成為目前研究的熱點。自噬是一種真核細胞內(nèi)進化上高度保守的溶酶體依賴性降解途徑,其負責胞質(zhì)細胞器和長壽命蛋白質(zhì)的降解。近年來研究發(fā)現(xiàn)自噬在腫瘤細胞中除了具有抗癌作用,同時還具有促進腫瘤細胞生存的作用,與化療藥物耐藥關(guān)系密切。AMPK (5'-AMP activated protein kinase,磷酸腺苷活化蛋白激酶)是存在于真核細胞中重要的能量狀態(tài)感受器和調(diào)節(jié)器,研究認為活化的AMPK不僅調(diào)節(jié)細胞的能量代謝平衡,還與細胞凋亡、氧化應激和自噬相關(guān)。目前AMPK-自噬與硼替佐米化療增敏的關(guān)系及其具體調(diào)控機制尚無研究報道。前期研究結(jié)果證實,硼替佐米能顯著抑制結(jié)腸癌細胞的存活,并誘導癌細胞凋亡。本研究將以mPTP (mitochondrial permeablity transition pore,線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔)-Cyto-C (cyto-chrome C,細胞色素C)通路為著眼點,研究硼替佐米抗結(jié)腸癌細胞的分子機制；并進一步以AMPK-自噬信號通路為靶點,研究結(jié)腸癌細胞株對硼替佐米耐藥的可能分子機制,尋找可能的逆轉(zhuǎn)靶點,以增加硼替佐米的療效。本研究共分三個部分：第一部分研究硼替佐米抗結(jié)腸癌作用及其分子機制；第二部分研究硼替佐米誘導結(jié)腸癌細胞保護性自噬；第三部分研究硼替佐米通過介導TAKl (TGF-β-activated kinase 1,轉(zhuǎn)化生長因子激酶1)-AMPK通路誘導結(jié)腸癌細胞保護性自噬。第一部分 硼替佐米抗結(jié)腸癌作用及其分子機制的研究目的觀察硼替佐米抗結(jié)腸癌的作用,解析其可能分子機制。方法以結(jié)腸癌細胞株HT-29、HCT-116以及SW-620為研究對象,采用MTT法觀察硼替佐米對結(jié)腸癌細胞增殖的影響,采用臺盼藍排斥法觀察硼替佐米對結(jié)腸癌細胞死亡的影響。以結(jié)腸癌細胞株HT-29為研究對象,采用流式細胞儀觀察硼替佐米對結(jié)腸癌細胞凋亡及細胞周期的影響,JC-10熒光定量法檢測硼替佐米對結(jié)腸癌細胞MMP的影響,Western Blot法檢測硼替佐米對結(jié)腸癌細胞Cyto-C蛋白表達水平的影響。進一步以硼替佐米處理的HT-29為研究對象,加入mPTP抑制劑SFA和CSA, MTT法觀察處理前后對結(jié)腸癌細胞增殖的影響,JC-10熒光定量法檢測處理前后對結(jié)腸癌細胞MMP的影響,Western Blot法檢測處理前后對結(jié)腸癌細胞Cyto-C蛋白表達水平的影響。結(jié)果與對照組相比,硼替佐米組結(jié)腸癌細胞株]HT-29、HCT-116以及SW-620存活率下降、死亡率上升,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。與對照組相比,硼替佐米組結(jié)腸癌細胞株HT-29細胞凋亡上升、細胞周期G1期阻滯、MMP下降、Cyto-C蛋白表達水平上升。與單硼替佐米組相比,加入SFA或CSA的硼替佐米組細胞存活率上升、MMP上升、Cyto-C蛋白表達水平下降。結(jié)論硼替佐米抑制結(jié)腸癌細胞增殖、促進死亡、誘導凋亡和細胞周期G1期阻滯；誘導MMP下降、nPTP開放及細胞色素C釋放可能是硼替佐米抗結(jié)腸癌活性的核心分子事件。因此,以硼替佐米為代表的蛋白酶體抑制劑有望作為新型的抗結(jié)腸癌藥物。第二部分 硼替佐米誘導結(jié)腸癌細胞保護性自噬目的明確硼替佐米誘導結(jié)腸癌細胞自噬與化療抵抗的關(guān)系。方法以結(jié)腸癌細胞株HT-29為研究對象,加入硼替佐米(100nmol/L,12或24小時),熒光顯微鏡下采用GFP-LC3B融合蛋白來示蹤硼替佐米對細胞自噬形成的影響,采用Western Blot法檢測硼替佐米對細胞LC3B-I、LC3B-Ⅱ、自噬相關(guān)蛋白Beclin-1及p62的蛋白表達水平、Ulk1磷酸化水平的影響；以硼替佐米處理后的結(jié)腸癌細胞HT-29為研究對象,加入自噬抑制劑3-MA(1 mmol/L)或氯喹(400 μmol/L),流式細胞儀觀察細胞凋亡的變化,MTT法檢測細胞增殖的變化。結(jié)果與對照組相比,硼替佐米處理組GFP-LC3B融合蛋白細胞比例明顯增多,LC3B-Ⅰ蛋白表達下降,LC3B-Ⅱ蛋白表達上升,Beclin-1蛋白表達水平上升,p62蛋白表達水平下降,Ulk1磷酸化水平上升。與單硼替佐米組相比,加入3-MA或氯喹的硼替佐米組細胞凋亡增加、存活率下降,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。結(jié)論硼替佐米同時誘導結(jié)腸癌細胞凋亡和自噬。硼替佐米誘導的結(jié)腸癌細胞自噬促進腫瘤細胞存活,是結(jié)腸癌細胞對硼替佐米耐藥的可能機制。第三部分 硼替佐米通過介導TAK1-AMPK通路誘導結(jié)腸癌細胞保護性自噬目的解析TAK1-AMPK-自噬信號通路在結(jié)腸癌對硼替佐米耐藥中的作用。方法以結(jié)腸癌細胞HT-29為研究對象,采用Western Blot法檢測硼替佐米對細胞株AMPKa及ACC總蛋白和磷酸化水平的影響。以硼替佐米處理后的結(jié)腸癌細胞HT-29為研究對象,采用慢病毒shRNA敲減AMPKa或加入AMPK抑制劑Compund C,熒光顯微鏡下采用GFP-LC3B融合蛋白來示蹤處理后細胞自噬形成并進行計數(shù),Western Blot法檢測LC3B-Ⅱ蛋白表達和Ulk1磷酸化水平的變化,流式細胞儀檢測凋亡的變化,MTT法檢測細胞增殖的變化。采用慢病毒shRNA敲減TAK1,Western Blot法檢測AMPKa磷酸化、Beclin-1和p62蛋白表達水平變化,流式細胞儀檢測細胞凋亡的變化,MTT法檢測細胞增殖的變化。結(jié)果與對照組相比,硼替佐米處理組AMPKα、 ACC和TAK1的磷酸化表達水平明顯上升。與對照組相比,敲減AMPKα或加入Compund C組GFP-LC3B融合蛋白細胞比例顯著下降、凋亡增加、存活率下降,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05),敲減AMPKa組總AMPK、ACC、LC3B-Ⅱ蛋白表達水平及AMPK、ACC、Ulk1磷酸化水平均顯著下降。與對照組相比,敲減TAKl組AMPKa磷酸化水平及Beclin-1蛋白表達水平下降,p62蛋白表達水平上升。同時,細胞凋亡增加、存活率下降,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。結(jié)論AMPK-自噬通路是結(jié)腸癌細胞對硼替佐米耐藥的可能機制,抑制／敲減AMPK可以增加結(jié)腸癌細胞對硼替佐米的敏感性。TAK1可能是結(jié)腸癌細胞中硼替佐米激活AMPK-自噬的上游激酶,具體的調(diào)控方式還有待于進一步研究。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.35

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本文編號：2327543