發(fā)布時(shí)間：2018-11-12 16:04

【摘要】：研究背景結(jié)腸癌是一種常見的消化道腫瘤,在我國(guó)發(fā)病率逐年上升。近20年來,盡管手術(shù)和化療方式有了很大進(jìn)步,但患者總體生存率并無顯著提高。因此,探索結(jié)腸癌發(fā)生和發(fā)展新機(jī)制,尋找新的臨床干預(yù)思路和策略顯得尤為重要。硼替佐米(Bortezomib, PS-341)是全球第一個(gè)合成的26S蛋白酶體抑制劑。體外試驗(yàn)證明硼替佐米對(duì)多種類型的癌細(xì)胞具有細(xì)胞毒性。由于臨床研究證實(shí)硼替佐米對(duì)多發(fā)性骨髓瘤和套細(xì)胞淋巴瘤的療效反應(yīng),因此美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局通過準(zhǔn)許其用于這類病人。目前,在包括結(jié)腸癌在內(nèi)的實(shí)體瘤研究正在逐步開展,但臨床研究發(fā)現(xiàn)單用硼替佐米在實(shí)體瘤中的作用有限,可能與化療抵抗或其他機(jī)制有關(guān)。因此,硼替佐米的化療增敏成為目前研究的熱點(diǎn)。自噬是一種真核細(xì)胞內(nèi)進(jìn)化上高度保守的溶酶體依賴性降解途徑,其負(fù)責(zé)胞質(zhì)細(xì)胞器和長(zhǎng)壽命蛋白質(zhì)的降解。近年來研究發(fā)現(xiàn)自噬在腫瘤細(xì)胞中除了具有抗癌作用,同時(shí)還具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生存的作用,與化療藥物耐藥關(guān)系密切。AMPK (5'-AMP activated protein kinase,磷酸腺苷活化蛋白激酶)是存在于真核細(xì)胞中重要的能量狀態(tài)感受器和調(diào)節(jié)器,研究認(rèn)為活化的AMPK不僅調(diào)節(jié)細(xì)胞的能量代謝平衡,還與細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激和自噬相關(guān)。目前AMPK-自噬與硼替佐米化療增敏的關(guān)系及其具體調(diào)控機(jī)制尚無研究報(bào)道。前期研究結(jié)果證實(shí),硼替佐米能顯著抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的存活,并誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。本研究將以mPTP (mitochondrial permeablity transition pore,線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔)-Cyto-C (cyto-chrome C,細(xì)胞色素C)通路為著眼點(diǎn),研究硼替佐米抗結(jié)腸癌細(xì)胞的分子機(jī)制；并進(jìn)一步以AMPK-自噬信號(hào)通路為靶點(diǎn),研究結(jié)腸癌細(xì)胞株對(duì)硼替佐米耐藥的可能分子機(jī)制,尋找可能的逆轉(zhuǎn)靶點(diǎn),以增加硼替佐米的療效。本研究共分三個(gè)部分：第一部分研究硼替佐米抗結(jié)腸癌作用及其分子機(jī)制；第二部分研究硼替佐米誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞保護(hù)性自噬；第三部分研究硼替佐米通過介導(dǎo)TAKl (TGF-β-activated kinase 1,轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子激酶1)-AMPK通路誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞保護(hù)性自噬。第一部分 硼替佐米抗結(jié)腸癌作用及其分子機(jī)制的研究目的觀察硼替佐米抗結(jié)腸癌的作用,解析其可能分子機(jī)制。方法以結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29、HCT-116以及SW-620為研究對(duì)象,采用MTT法觀察硼替佐米對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響,采用臺(tái)盼藍(lán)排斥法觀察硼替佐米對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞死亡的影響。以結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29為研究對(duì)象,采用流式細(xì)胞儀觀察硼替佐米對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響,JC-10熒光定量法檢測(cè)硼替佐米對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞MMP的影響,Western Blot法檢測(cè)硼替佐米對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞Cyto-C蛋白表達(dá)水平的影響。進(jìn)一步以硼替佐米處理的HT-29為研究對(duì)象,加入mPTP抑制劑SFA和CSA, MTT法觀察處理前后對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響,JC-10熒光定量法檢測(cè)處理前后對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞MMP的影響,Western Blot法檢測(cè)處理前后對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞Cyto-C蛋白表達(dá)水平的影響。結(jié)果與對(duì)照組相比,硼替佐米組結(jié)腸癌細(xì)胞株]HT-29、HCT-116以及SW-620存活率下降、死亡率上升,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。與對(duì)照組相比,硼替佐米組結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29細(xì)胞凋亡上升、細(xì)胞周期G1期阻滯、MMP下降、Cyto-C蛋白表達(dá)水平上升。與單硼替佐米組相比,加入SFA或CSA的硼替佐米組細(xì)胞存活率上升、MMP上升、Cyto-C蛋白表達(dá)水平下降。結(jié)論硼替佐米抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)死亡、誘導(dǎo)凋亡和細(xì)胞周期G1期阻滯；誘導(dǎo)MMP下降、nPTP開放及細(xì)胞色素C釋放可能是硼替佐米抗結(jié)腸癌活性的核心分子事件。因此,以硼替佐米為代表的蛋白酶體抑制劑有望作為新型的抗結(jié)腸癌藥物。第二部分 硼替佐米誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞保護(hù)性自噬目的明確硼替佐米誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞自噬與化療抵抗的關(guān)系。方法以結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29為研究對(duì)象,加入硼替佐米(100nmol/L,12或24小時(shí)),熒光顯微鏡下采用GFP-LC3B融合蛋白來示蹤硼替佐米對(duì)細(xì)胞自噬形成的影響,采用Western Blot法檢測(cè)硼替佐米對(duì)細(xì)胞LC3B-I、LC3B-Ⅱ、自噬相關(guān)蛋白Beclin-1及p62的蛋白表達(dá)水平、Ulk1磷酸化水平的影響；以硼替佐米處理后的結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29為研究對(duì)象,加入自噬抑制劑3-MA(1 mmol/L)或氯喹(400 μmol/L),流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞凋亡的變化,MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖的變化。結(jié)果與對(duì)照組相比,硼替佐米處理組GFP-LC3B融合蛋白細(xì)胞比例明顯增多,LC3B-Ⅰ蛋白表達(dá)下降,LC3B-Ⅱ蛋白表達(dá)上升,Beclin-1蛋白表達(dá)水平上升,p62蛋白表達(dá)水平下降,Ulk1磷酸化水平上升。與單硼替佐米組相比,加入3-MA或氯喹的硼替佐米組細(xì)胞凋亡增加、存活率下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。結(jié)論硼替佐米同時(shí)誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡和自噬。硼替佐米誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞自噬促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活,是結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)硼替佐米耐藥的可能機(jī)制。第三部分 硼替佐米通過介導(dǎo)TAK1-AMPK通路誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞保護(hù)性自噬目的解析TAK1-AMPK-自噬信號(hào)通路在結(jié)腸癌對(duì)硼替佐米耐藥中的作用。方法以結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29為研究對(duì)象,采用Western Blot法檢測(cè)硼替佐米對(duì)細(xì)胞株AMPKa及ACC總蛋白和磷酸化水平的影響。以硼替佐米處理后的結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29為研究對(duì)象,采用慢病毒shRNA敲減AMPKa或加入AMPK抑制劑Compund C,熒光顯微鏡下采用GFP-LC3B融合蛋白來示蹤處理后細(xì)胞自噬形成并進(jìn)行計(jì)數(shù),Western Blot法檢測(cè)LC3B-Ⅱ蛋白表達(dá)和Ulk1磷酸化水平的變化,流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡的變化,MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖的變化。采用慢病毒shRNA敲減TAK1,Western Blot法檢測(cè)AMPKa磷酸化、Beclin-1和p62蛋白表達(dá)水平變化,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡的變化,MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖的變化。結(jié)果與對(duì)照組相比,硼替佐米處理組AMPKα、 ACC和TAK1的磷酸化表達(dá)水平明顯上升。與對(duì)照組相比,敲減AMPKα或加入Compund C組GFP-LC3B融合蛋白細(xì)胞比例顯著下降、凋亡增加、存活率下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),敲減AMPKa組總AMPK、ACC、LC3B-Ⅱ蛋白表達(dá)水平及AMPK、ACC、Ulk1磷酸化水平均顯著下降。與對(duì)照組相比,敲減TAKl組AMPKa磷酸化水平及Beclin-1蛋白表達(dá)水平下降,p62蛋白表達(dá)水平上升。同時(shí),細(xì)胞凋亡增加、存活率下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。結(jié)論AMPK-自噬通路是結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)硼替佐米耐藥的可能機(jī)制,抑制／敲減AMPK可以增加結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)硼替佐米的敏感性。TAK1可能是結(jié)腸癌細(xì)胞中硼替佐米激活A(yù)MPK-自噬的上游激酶,具體的調(diào)控方式還有待于進(jìn)一步研究。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.35

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10 謝亞萍;錢R季，

本文編號(hào)：2327543