【摘要】：研究背景:目前,肺癌是全球發(fā)病率和致死率最高的惡性腫瘤。臨床上,肺癌的組織類型主要包括非小細(xì)胞肺癌(Non-small Cell Lung Cancer,NSCLC)和小細(xì)胞肺癌(Small Cell Lung Cancer,SCLC)。在臨床肺癌病例中,NSCLC類型最常見,所占比例高達(dá)80%左右。傳統(tǒng)治療肺癌患者的方法主要包括放療、化療及手術(shù)切除。由于肺癌細(xì)胞具有惡性增殖能力強(qiáng),易侵襲和轉(zhuǎn)移、放化療不敏感等特點(diǎn),導(dǎo)致肺癌晚期患者生存預(yù)后不佳,總體5年生存率僅有10%左右。為了提高肺癌治愈率、改善治療預(yù)后,尋找和鑒別早期診斷和預(yù)后的腫瘤標(biāo)記物,并深入探討其在癌癥發(fā)生發(fā)展過程中的分子機(jī)制是非常重要的。腫瘤干細(xì)胞和干細(xì)胞功能基本一樣,都具有自我更新和無限增殖的能力,具有高遷移侵襲能力,和排出有毒化學(xué)因子的能力。因此,腫瘤干細(xì)胞也被認(rèn)為在藥物耐藥性及腫瘤轉(zhuǎn)移中起著重要的作用。已有文章明確表明腫瘤干細(xì)胞乳腺癌、胃癌、非小細(xì)胞肺癌等密切相關(guān)。由人類5pl3染色體上基因編碼的高爾基磷酸蛋白3(Golgi phosphorprotein3,GOLPH3),是一類與高爾基體囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白糖基化及蛋白分選相關(guān)的磷蛋白。GOLPH3是首個(gè)定位于反面高爾基網(wǎng)(Trans-Golgi Network,TGN)的癌基因,已證實(shí)了GOLPH3與包括NSCLC在內(nèi)的多種癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),但GOLPH3在NSCLC干細(xì)胞樣表型中的臨床意義和生物學(xué)功能還知之甚少。Wnt/β-catenin信號(hào)通路是調(diào)節(jié)干細(xì)胞分化的主要信號(hào)通路,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin信號(hào)通路與肺癌、結(jié)腸癌、肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。因此,進(jìn)行GOLPH3在NSCLC干細(xì)胞樣表型中的研究具有非常重要的臨床意義。目的:本課題擬在體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,輔以生物信息學(xué)分析技術(shù),研究GOLPH3在促進(jìn)NSCLC干細(xì)胞樣表型增強(qiáng)中的生物學(xué)功能,并初步探究GOLPH3通過Wnt-β-catenin-LEF1/TCF4通路調(diào)控NSCLC干細(xì)胞樣表型增強(qiáng)的可能機(jī)制。方法:Western Blot檢測(cè)已構(gòu)建的A549、NCI-H460細(xì)胞系中GOLPH3的表達(dá)穩(wěn)定性;在NCBI-NSCLC公用數(shù)據(jù)庫中,用SPSS分析軟件分析GOLPH3的表達(dá)與腫瘤干細(xì)胞markers之間的關(guān)系;在構(gòu)建好的穩(wěn)定細(xì)胞系中,用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)、側(cè)群細(xì)胞檢測(cè)實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn),分別檢測(cè)GOLPH3的表達(dá)對(duì)腫瘤干細(xì)胞markers轉(zhuǎn)錄情況的影響、對(duì)側(cè)群細(xì)胞所占比例的影響、對(duì)NSCLC細(xì)胞成球能力的影響。購買SPF級(jí)的4-5周齡Balb/c裸鼠,隨機(jī)分組,收集構(gòu)建好的穩(wěn)定A549細(xì)胞系細(xì)胞,分成不同的濃度,皮下注射到裸鼠腹股溝處,觀察裸鼠的成瘤情況,每隔3天測(cè)量一次瘤塊大小;30天后猝死裸鼠,剝離出腫瘤塊,稱重并計(jì)算體積。用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腫瘤組織塊中GOLPH3及腫瘤干細(xì)胞markers(CD133、ALDH1A1)的蛋白表達(dá)水平。通過基因富集分析軟件(Gene Set Enrichment Analysis,GSEA)預(yù)測(cè)GOLPH3促進(jìn)NSCLC干細(xì)胞樣表型增強(qiáng)的潛在分子機(jī)制,并采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)GOLPH3是否通過激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)NSCLC干性增強(qiáng);采用免疫熒光實(shí)驗(yàn)、核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)檢測(cè)構(gòu)建的穩(wěn)定細(xì)胞系中GOLPH3的表達(dá)對(duì)β-catenin分布情況的影響。并用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)GOLPH3對(duì)下游干細(xì)胞樣表型相關(guān)靶基因轉(zhuǎn)錄水平的影響。用Lipo3000將si RNA(si TCF4/si LEF1)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到GOLPH3穩(wěn)定高表達(dá)的A549、NCI-H460細(xì)胞系中構(gòu)建TCF4/LEF1沉默表達(dá)的NSCLC細(xì)胞系;在構(gòu)建的瞬時(shí)細(xì)胞系中,用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活性;側(cè)群細(xì)胞檢測(cè)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)側(cè)群細(xì)胞所占比例的變化;實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)下游干細(xì)胞樣表型相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果:Western Blot檢測(cè)已構(gòu)建的A549、NCI-H460細(xì)胞系中GOLPH3的表達(dá)情況時(shí),發(fā)現(xiàn)GOLPH3的高、低表達(dá)趨勢(shì)都很明顯,說明構(gòu)建的NSCLC細(xì)胞系穩(wěn)定性較好,可以繼續(xù)進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。SPSS軟件分析發(fā)現(xiàn):公用數(shù)據(jù)庫中GOLPH3的表達(dá)與腫瘤干細(xì)胞makers(ABCG2、ALDH1A1、CD133、c-Myc、Sox2)的表達(dá)呈現(xiàn)正相關(guān)性,且p0.01。初步說明NSCLC中,GOLPH3的表達(dá)可能與腫瘤干細(xì)胞樣表型相關(guān)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的結(jié)果也表明,GOLPH3高表達(dá)時(shí),腫瘤干細(xì)胞markers的轉(zhuǎn)錄水平升高;GOLPH3低表達(dá)時(shí),腫瘤干細(xì)胞markers的轉(zhuǎn)錄水平降低。側(cè)群細(xì)胞檢測(cè)實(shí)驗(yàn)表明:GOLPH3高表達(dá)時(shí),側(cè)群細(xì)胞占總細(xì)胞比例較大;GOLPH3低表達(dá)時(shí),側(cè)群細(xì)胞占總細(xì)胞比例較小。干細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示:相比于對(duì)照組,當(dāng)GOLPH3高表達(dá)時(shí),細(xì)胞形成干細(xì)胞球的能力較強(qiáng),小球形成的體積更大,數(shù)量更多,且速度更快;GOLPH3低表達(dá)時(shí),細(xì)胞形成干細(xì)胞的能力則較弱,小球形成體積較小,數(shù)量較少,速度緩慢。這些體外實(shí)驗(yàn)充分說明:NSCLC中,GOLPH3高表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞樣表型增強(qiáng),GOLPH3低表達(dá)則抑制腫瘤的干細(xì)胞樣表型。裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn):GOLPH3高表達(dá)可以使裸鼠體內(nèi)種植的腫瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的致瘤能力,腫瘤塊形成的體積更大,速度更快;GOLPH3沉默表達(dá)時(shí),裸鼠體內(nèi)種植的腫瘤細(xì)胞的致瘤能力明顯低于對(duì)照組,無論是腫瘤塊形成的體積還是速度,都明顯小于對(duì)照組。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也說明了:NSCLC中,GOLPH3高表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞樣表型增強(qiáng),GOLPH3低表達(dá)則抑制腫瘤的干細(xì)胞樣表型。通過GSEA分析發(fā)現(xiàn)GOLPH3與Wnt/β-catenin信號(hào)通路呈現(xiàn)正相關(guān),且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn):GOLPH3高表達(dá)可以激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路,下調(diào)GOLPH3的表達(dá)則抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活性。免疫熒光實(shí)驗(yàn)、核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):GOLPH3高表達(dá)可以促進(jìn)β-catenin由細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核并累積,在核蛋白中呈現(xiàn)高表達(dá);GOLPH3低表達(dá)時(shí),β-catenin主要分布于細(xì)胞質(zhì)中,在核蛋白中表達(dá)水平很低。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果也發(fā)現(xiàn):GOLPH3高表達(dá)時(shí),Wnt/β-catenin信號(hào)通路下游的干細(xì)胞樣表型相關(guān)靶基因轉(zhuǎn)錄水平較高;GOLPH3低表達(dá)時(shí),Wnt/β-catenin信號(hào)通路下游的干細(xì)胞樣表型相關(guān)靶基因轉(zhuǎn)錄水平則較低。沉默掉TCF4/LEF1后,側(cè)群細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示:相比于對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組總細(xì)胞中側(cè)群細(xì)胞所占比例明顯降低。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果也顯示:相比于對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)通路下游的干細(xì)胞樣表型相關(guān)靶基因轉(zhuǎn)錄水平明顯降低。這些結(jié)果有力說明了:GOLPH3促進(jìn)NSCLC干細(xì)胞樣表型增強(qiáng)的過程受Wnt/β-catenin信號(hào)通路的調(diào)控。結(jié)論:實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,癌基因GOLPH3的表達(dá)可以調(diào)控NSCLC干細(xì)胞樣表型的強(qiáng)弱,GOLPH3高表達(dá)可促進(jìn)NSCLC干細(xì)胞樣表型增強(qiáng),GOLPH3低表達(dá)則抑制NSCLC的干細(xì)胞樣表型。上調(diào)GOLPH3的表達(dá)可以激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路,在信號(hào)因子的刺激下,β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子TCF4/LEF1結(jié)合,啟動(dòng)下游靶基因的表達(dá),增強(qiáng)NSCLC腫瘤干細(xì)胞樣表型。沉默TCF4/LEF1可以阻斷Wnt/β-catenin信號(hào)通路,GOLPH3高表達(dá)增強(qiáng)NSCLC干細(xì)胞樣表型增強(qiáng)的能力下降。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：深圳大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R734.2

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本文編號(hào)：2327526