【摘要】：[目的]根據(jù)2014年《中國乳腺癌》報(bào)道,乳腺癌是中國女性腫瘤患者中發(fā)病率居首位,死亡率居第五位的惡性腫瘤。盡管目前一些乳腺癌患者得到了有效的治療,但仍具有很高的復(fù)發(fā)率。極微量的乳腺癌干細(xì)胞是存在于乳腺癌組織中具有自我更新和分化潛能的細(xì)胞,是腫瘤形成的起始細(xì)胞,維持腫瘤生長、放化療耐受和新生血管形成,是腫瘤發(fā)生發(fā)展以及復(fù)發(fā)的根源。乳腺癌起始細(xì)胞具有成瘤活性,并高表達(dá)CD44+/CD24-/low和其他干細(xì)胞標(biāo)志物,如CD133、ALDH1和CD55等,表現(xiàn)出干細(xì)胞樣特征。采取分選鑒定干細(xì)胞樣乳腺癌細(xì)胞將能更清晰認(rèn)識其特征,從而尋找更有效的方法治療乳腺癌,防止其復(fù)發(fā)以提高臨床治愈率。免疫治療利用機(jī)體自身免疫系統(tǒng)靶向腫瘤,可以克服常規(guī)治療方法的不足。目前一種新的免疫治療策略是利用基于樹突狀細(xì)胞(Dendritic Cell, DC)疫苗啟動(dòng)T淋巴細(xì)胞,介導(dǎo)抗腫瘤免疫作用。但是,使用人乳腺癌干細(xì)胞作為抗原是否可以增強(qiáng)DC抗乳腺癌干細(xì)胞的免疫作用尚不清楚。本研究中我們分離并鑒定了來源于乳腺癌患者手術(shù)后腫瘤組織的干細(xì)胞樣乳腺癌細(xì)胞,探索干細(xì)胞樣乳腺癌細(xì)胞裂解物作為抗原,負(fù)載DC刺激誘導(dǎo)靶向人乳腺癌干細(xì)胞的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的抑瘤活性,達(dá)到增強(qiáng)免疫功能和提高抗腫瘤免疫的目的。本項(xiàng)研究擬通過采集臨床乳腺癌患者手術(shù)后腫瘤組織,分離培養(yǎng)獲得干細(xì)胞樣乳腺癌細(xì)胞(Breast cancer Stem-like Cell, BSC),經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定其干細(xì)胞標(biāo)志物,建立動(dòng)物模型觀察其體內(nèi)成瘤性。將BSC制備成細(xì)胞裂解物負(fù)載DC后激活毒性T淋巴細(xì)胞(Cytotoxic T Lymphocytes, CTL),獲得經(jīng)負(fù)載BSC裂解物的DC激活的CTL (BSC-CTL)。體外殺傷實(shí)驗(yàn)分析BSC-CTL抗乳腺癌干細(xì)胞的活性,ELISPOT實(shí)驗(yàn)觀察IFN-γ表達(dá)情況,動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究BSC-CTL的抑瘤能力,為靶向BSC的治療提供新的理論依據(jù)。[方法]經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)討論并簽署知情同意書,收集16位乳腺癌患者手術(shù)后腫瘤組織,臨床診斷經(jīng)組織學(xué)和病理學(xué)確認(rèn)。機(jī)械法處理腫瘤組織,所得組織碎片用膠原酶和透明質(zhì)酸酶消化過濾獲得乳腺癌單細(xì)胞懸液,用含有bFGF、EGF、胰島素和B27的無血清DMEM-F12(1:1)培養(yǎng)基培養(yǎng),分散的乳腺癌細(xì)胞成乳腺球樣生長。使用抗CD44-PE、抗CD24-FITC和抗CD133-PE進(jìn)行染色,檢測其干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)水平,以及在動(dòng)物體內(nèi)分析其成瘤性和轉(zhuǎn)移能力。經(jīng)Ficoll/Paque淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心獲得正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell, PBMC),誘導(dǎo)成未成熟DC并負(fù)載BSC獲得成熟DC；成熟DC 3次刺激T淋巴細(xì)胞得到毒性T淋巴細(xì)胞(Cytotoxic T Lymphocytes. CTL),通過CytoTox 96非放射性細(xì)胞毒性試劑盒檢測乳酸脫氫酶(Lactate Dehydrogenase, LDH)釋放,以及IFNγ ELISPOT檢測IFNγ表達(dá)水平分析其對BSC殺傷活性。建立荷乳腺癌干細(xì)胞的動(dòng)物模型,接種后第7、9、11天尾靜脈注射1×105/g劑量的成熟DC激活的CTL,研究DC靶向乳腺癌干細(xì)胞的抗腫瘤的免疫功能。[結(jié)果](1)乳腺癌單細(xì)胞經(jīng)48小時(shí)無血清培養(yǎng)后,一部分乳腺癌單細(xì)胞懸浮生長,逐漸形成微小乳腺球,繼續(xù)培養(yǎng)能夠形成較大的乳腺球；一部分貼壁生長；一部分在培養(yǎng)過程中發(fā)生凋亡或保持不分化。采用流式細(xì)胞儀檢測干細(xì)胞標(biāo)志物CD44和CD24表達(dá)水平；其中來自6例乳腺癌患者(占總數(shù)的37.5%)腫瘤組織的成乳腺球狀懸浮生長的腫瘤細(xì)胞表達(dá)高比例的CD44+/CD24-/low;該6位患者中,4位免疫組化HER-2(-)、ER(-)和PR(-),1位HER-2 (+/++)、ER(-)和PR(-),另外一位HER-2(+)、ER(+)和PR(-)。來自于患者7和患者11的乳腺球細(xì)胞表達(dá)CD44+/CD24-/low的比例分別為97.69%和99.45%。(2)與在乳腺癌單細(xì)胞培養(yǎng)過程中貼壁生長的腫瘤細(xì)胞相比較,成乳腺球狀懸浮生長的細(xì)胞具有更明顯的干細(xì)胞特征。流式細(xì)胞儀檢測成乳腺球細(xì)胞和乳腺癌貼壁細(xì)胞中CD44+/CD24-/low比例分別為91.8%和0.08%,然而在貼壁細(xì)胞中CD44+/CD24+雙陽性比例大大高于成乳腺球細(xì)胞,分別為61.59%和0.77%；干細(xì)胞標(biāo)志物CD133在成乳腺球狀懸浮生長的細(xì)胞中高表達(dá),患者9的成乳腺球細(xì)胞和貼壁細(xì)胞中表達(dá)CD133比例分別為96.67%和43.78%。經(jīng)免疫熒光檢測雌性激素受體(Estrogen Receptor, ER)、孕酮激素受體(Progesterone Receptor, PR)和人表皮生長因子受體(Human Epidermal Growth Factor Receptor 2, HER-2, or ErbB-2),觀察到貼壁細(xì)胞表達(dá)ER、PR和HER-2抗原,但成乳腺球細(xì)胞卻不表達(dá)。(3)接種了1×104個(gè)成乳腺球狀懸浮生長的乳腺癌細(xì)胞的裸鼠在5天內(nèi)就形成了腫瘤,而接種了1×106個(gè)貼壁細(xì)胞生長的乳腺癌細(xì)胞的裸鼠在7天后才形成腫瘤；成乳腺球細(xì)胞接種的全部小鼠在第10天時(shí)均出現(xiàn)了肝和肺轉(zhuǎn)移,然而,移植了1×106貼壁細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)組中觀察到僅有一只小鼠出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移；因此,乳腺癌患者腫瘤組織來源的成乳腺球狀懸浮生長的腫瘤細(xì)胞具有乳腺癌干細(xì)胞特征。鑒于此,為了表述方便起見,在本研究中亦稱這群乳腺癌患者腫瘤組織來源的成乳腺球狀懸浮生長的腫瘤細(xì)胞為干細(xì)胞樣乳腺癌細(xì)胞(Breast cancer stem-like cell, BSC)。(4)分別負(fù)載了乳腺球細(xì)胞裂解物、貼壁細(xì)胞裂解物以及無抗原誘導(dǎo)成熟的DC,分別激活T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生CTL活性,各組間殺傷乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性均隨著效靶比升高而不斷提高。1)負(fù)載了成乳腺球樣懸浮生長的干細(xì)胞樣乳腺癌細(xì)胞裂解物的DC刺激T淋巴細(xì)胞得到的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(BSC-CTL)對乳腺球細(xì)胞殺傷活性明顯高于貼壁生長的乳腺癌細(xì)胞裂解物負(fù)載DC刺激T淋巴細(xì)胞得到的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(BAC-CTL)對乳腺球細(xì)胞的殺傷活性(P0.01)；2) BSC-CTL對乳腺球細(xì)胞殺傷活性明顯高于對照組(Blank-CTL),(P0.01)；3) BAC-CTL對乳腺球細(xì)胞的殺傷活性與對照組近似；4) BAC-CTL對貼壁細(xì)胞的殺傷活性大于BSC-CTL對貼壁細(xì)胞的殺傷活性(P0.05)5) BAC-CTL;對貼壁細(xì)胞的殺傷活性高于Blank-CTL對貼壁細(xì)胞的殺傷活性(P0.05)；6) BSC-CTL對貼壁細(xì)胞的殺傷活性與對照組近似；7) BAC-CTL對貼壁細(xì)胞的殺傷活性明顯高于對乳腺球細(xì)胞的殺傷活性(P0.01)；8) BSC-CTL對乳腺球細(xì)胞的殺傷活性高于對貼壁細(xì)胞的殺傷活性(P0.05)。(5)乳腺癌細(xì)胞抗原刺激DC誘導(dǎo)重要的T細(xì)胞應(yīng)答, BSC-CTL和BAC-CTL對乳腺球細(xì)胞效靶比為10：1殺傷應(yīng)答中產(chǎn)生IFNγ分泌斑點(diǎn)數(shù)分別為52個(gè)和31個(gè)；通過斑點(diǎn)計(jì)數(shù)和計(jì)算覆蓋面積,BSC-CTL產(chǎn)生的IFNγ明顯高于BAC-CTL(P0.05),并且BSC-CTL和BAC-CTL產(chǎn)生的IFN-y明顯高于Blank-CTL(P0.01和P0.05),另外,效靶比的提高也顯著增加了IFNγ產(chǎn)生的斑點(diǎn)數(shù)和覆蓋面積。(6)5周齡NOD/SCID小鼠右前肢腋腔皮下乳腺脂肪墊接種BSC。Blank-CTL免疫治療的全部荷瘤小鼠平均存活31.4天。使用BAC-CTL免疫治療的小鼠存活時(shí)間平均值為35天,而使用BSC-CTL免疫治療的小鼠平均存活期為56.1天,監(jiān)控時(shí)間增加到70天時(shí),還有40%小鼠存活著；Kaplan-Meier生存期曲線分析顯示BSC-CTL免疫治療的小鼠生存期小組顯著地高于其它實(shí)驗(yàn)組(P0.001)。[結(jié)論]本項(xiàng)研究中我們證實(shí)了BSC高表達(dá)干細(xì)胞相關(guān)分子,即CD44+/CD24-/low和CD133+,而BAC高表達(dá)CD44+/CD24+,同時(shí)低表達(dá)CD133+。BSC體內(nèi)成瘤能力強(qiáng)于BAC。應(yīng)用BSC裂解物負(fù)載的DC疫苗引發(fā)了特異的抗乳腺癌干細(xì)胞T淋巴細(xì)胞應(yīng)答。DC疫苗激活了Thl應(yīng)答和誘導(dǎo)了關(guān)鍵的IFN-y產(chǎn)生,與激活的CTL數(shù)量成正相關(guān)。在建立的乳腺癌干細(xì)胞動(dòng)物模型中,揭示了使用BSC-CTL具有顯著的抗BSC的免疫作用,而BAC-CTL沒有顯著的抗BSC免疫作用。BSC-CTL明顯地延長了荷乳腺癌干細(xì)胞動(dòng)物的存活時(shí)間。本研究結(jié)果證明了富含CD44+/CD24-/low/CD133+乳腺球的乳腺癌細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞(BSC)特征,應(yīng)用其抗原負(fù)載的DC疫苗產(chǎn)生了強(qiáng)大的抗腫瘤免疫,將可能提高乳腺癌干細(xì)胞特異性免疫治療的靶向性和加速腫瘤疫苗的發(fā)展。[目的]本研究的目的是探討CYP2C9*3多態(tài)性對格列齊特在Ⅱ型糖尿病患者的治療反應(yīng)的影響。[方法]本研究共納入746例Ⅱ型糖尿病患者。入選后,患者繼續(xù)4周格列齊特治療,治療前后測定空腹血糖。低血糖事件發(fā)生和生活方式的信息收集每周跟進(jìn)。rs1057910基因分型采用單堿基引物延伸法進(jìn)行。t檢驗(yàn)、方差分析和卡方檢驗(yàn)被用來評估rs1057910等位基因?qū)Ω窳旋R特治療反應(yīng)的影響。[結(jié)果]治療后,空腹血糖明顯下降,從11.2-2.7毫摩爾/升到8-2.2毫摩爾/升(P0.001)。rs1057910位點(diǎn)的AC/CC基因型患者相比于AA型空腹血漿葡萄糖降低程度更大(3.6 vs 3 mmol/L,P0001:31.4 vs 24.5%,P0.001),治療成功率更高(54.7 vs 37.5%,P0.001；51.4 vs 32.3%,P0.001；71.6 vs 48.3%,P0.001分別為1,2和3采用三種不同的判定標(biāo)準(zhǔn))。[討論]目前的研究表明在Ⅱ型糖尿病病人中rs1057910位點(diǎn)多態(tài)性顯著影響格列齊特的治療效果。風(fēng)險(xiǎn)等位基因與空腹血糖顯著降低和格列齊特單一藥物療法具有較高治療成功率相關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：延邊大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.9

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