【摘要】：研究背景肺癌是最為常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,其死亡率居惡性腫瘤的第一位,其中80～85%的患者為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)。大部分NSCLC病人初次診斷時(shí)已處于進(jìn)展期或已發(fā)生轉(zhuǎn)移。因此,探索NSCLC細(xì)胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制對(duì)于尋找NSCLC的治療靶點(diǎn)十分必要。腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是一個(gè)多種因素參與、多步驟完成的復(fù)雜過(guò)程,包括腫瘤細(xì)胞獲得更強(qiáng)的增殖生存和遷移侵襲能力、免疫逃逸以及腫瘤血管淋巴管生成等多個(gè)生物過(guò)程。而上述過(guò)程的啟動(dòng)和維持依賴(lài)于腫瘤細(xì)胞和間質(zhì)中多種多樣的細(xì)胞因子。近來(lái)越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)分子在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)且參與腫瘤的進(jìn)展轉(zhuǎn)移。免疫球蛋白樣轉(zhuǎn)錄子(immunoglobulin-like transcript, ILT)是一組免疫球蛋白超家族分子,其基因均定位于人19號(hào)染色體。依據(jù)功能性質(zhì),ILT家族成員被分為刺激性受體(ILT1,ILT6,ILT7和ILT8)和抑制性受體(ILT2,ILT3,ILT4和ILT5),其中抑制性受體的胞內(nèi)段含免疫受體酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif, ITIM),可發(fā)揮免疫抑制功能。本課題組之前的研究發(fā)現(xiàn)ILT4參與促進(jìn)NSCLC的進(jìn)展轉(zhuǎn)移。ILT3亦屬于ILT家族抑制性受體中的一員,主要在單核細(xì)胞以及樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells, DCs)等細(xì)胞中表達(dá)。目前,國(guó)內(nèi)外對(duì)ILT3的研究主要集中于該分子對(duì)抗原遞呈細(xì)胞的影響,使其無(wú)法激活免疫細(xì)胞,并參與移植耐受。但對(duì)ILT3在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)以及它們?cè)谀[瘤細(xì)胞中表達(dá)的作用報(bào)道較少。僅有報(bào)道ILT3在人慢性淋巴細(xì)胞白血病中的惡性B細(xì)胞,人胃癌細(xì)胞以及母雞自發(fā)性卵巢癌細(xì)胞中高表達(dá),且在慢性淋巴細(xì)胞白血病中ILT3的表達(dá)與淋巴組織浸潤(rùn)相關(guān)。此外,可溶性ILT3能夠抑制人源化SCID小鼠對(duì)同種異體腫瘤的排異,某些癌癥病人血清中存在可溶性ILT3,能夠誘導(dǎo)CD8+抑制性T細(xì)胞的分化和抑制混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)中的T細(xì)胞反應(yīng)。我們前期研究發(fā)現(xiàn)ILT3在NSCLC組織中高表達(dá),而在正常肺組織中低表達(dá)或無(wú)表達(dá),且腫瘤細(xì)胞中ILT3的表達(dá)與癌組織中腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(tumor infiltration lymphocytes, TILs)數(shù)量呈顯著負(fù)相關(guān)。ILT3在NSCLC組織中高表達(dá)提示其可能在促進(jìn)NSCLC進(jìn)展中發(fā)揮作用；然而對(duì)于ILT3在NSCLC發(fā)生進(jìn)展中的具體作用及其分子機(jī)制目前尚未見(jiàn)報(bào)道。研究目的為明確ILT3在NSCLC發(fā)生進(jìn)展中的作用,我們通過(guò)免疫組化和qPCR檢測(cè)NSCLC組織樣品和癌旁正常肺組織樣品中ILT3的表達(dá),并分析其表達(dá)與臨床病理參數(shù)及病人生存預(yù)后的相關(guān)性；然后通過(guò)轉(zhuǎn)染技術(shù),上調(diào)或下調(diào)NSCLC細(xì)胞中ILT3的表達(dá),檢測(cè)ILT3對(duì)NSCLC細(xì)胞增殖、抗凋亡和遷移侵襲等惡性生物學(xué)行為的影響；并進(jìn)行下游基因和分子通路的篩選,進(jìn)一步揭示ILT3發(fā)揮生物作用的分子機(jī)制,為探索ILT3在NSCLC生物治療中的潛在價(jià)值提供初步理論基礎(chǔ)。研究方法1.通過(guò)qPCR檢測(cè)ILT3 mRNA在NSCLC患者新鮮腫瘤組織和配對(duì)的癌旁正常肺組織中的表達(dá),統(tǒng)計(jì)分析ILT3在NSCLC組織和正常肺組織之間的表達(dá)差異。2.通過(guò)免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)ILT3在NSCLC組織及癌旁正常肺組織中的表達(dá)；依據(jù)免疫組化染色評(píng)分,統(tǒng)計(jì)分析腫瘤細(xì)胞內(nèi)ILT3的表達(dá)水平與NSCLC患者臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性；收集NSCLC患者的預(yù)后隨訪資料,應(yīng)用Kaplan-Meier法繪制生存曲線,分析ILT3的表達(dá)與NSCLC患者生存率之間的關(guān)系。3.通過(guò)qPCR和Western blot檢測(cè)ILT3在6株NSCLC細(xì)胞系中的表達(dá),篩選出高表達(dá)和低表達(dá)ILT3的細(xì)胞系。選擇內(nèi)源性低表達(dá)ILT3的細(xì)胞系H1650和H1299轉(zhuǎn)染ILT3表達(dá)質(zhì)粒上調(diào)ILT3的表達(dá)；選擇內(nèi)源性高表達(dá)ILT3的細(xì)胞系A(chǔ)549和H226轉(zhuǎn)染ILT3 shRNA質(zhì)粒下調(diào)ILT3表達(dá)。4.采用MTT生長(zhǎng)曲線檢測(cè)ILT3對(duì)NSCLC細(xì)胞增殖能力的影響：采用AnnexinV-FITC/PI染色檢測(cè)ILT3對(duì)NSCLC細(xì)胞抗凋亡能力的影響；采用Transwell遷移侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ILT3對(duì)NSCLC細(xì)胞遷移侵襲能力的影響。5.通過(guò)慢病毒感染和篩選獲得穩(wěn)定過(guò)表達(dá)ILT3的NSCLC細(xì)胞株ILT3/H1650和對(duì)照細(xì)胞株pEZ-Lv105/H1650。選用BALB/cNude裸鼠建立尾靜脈轉(zhuǎn)移模型,以體內(nèi)觀察ILT3對(duì)NSCLC細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響。6.采用Western blot檢測(cè)ILT3對(duì)MAPK和PI3K-Akt通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響,篩選出ILT3的下游信號(hào)通路；然后通過(guò)加入通路抑制劑,觀察ILT3過(guò)表達(dá)細(xì)胞在抑制相關(guān)信號(hào)通路后遷移侵襲能力的變化。7.采用Western blot檢測(cè)ILT3對(duì)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)指標(biāo)蛋白的調(diào)節(jié)作用。8.采用Western blot檢測(cè)ILT3對(duì)血管形成相關(guān)分子(VEGF-A、FGF1)的調(diào)節(jié)作用；并通過(guò)加入信號(hào)通路抑制劑,篩選ILT3發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的關(guān)鍵信號(hào)通路。收集過(guò)表達(dá)ILT3和干擾ILT3表達(dá)的NSCLC細(xì)胞的培養(yǎng)上清,檢測(cè)其對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vascular endothelial cell, HUVEC)血管形成的影響。9.FGF1是候選腫瘤標(biāo)記物分子,但目前尚沒(méi)有關(guān)于FGF1在NSCLC中表達(dá)的研究。本研究中通過(guò)免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)FGF1在NSCLC組織中的表達(dá),并分析其表達(dá)與病人臨床病理參數(shù)和生存預(yù)后的相關(guān)性。研究結(jié)果1.ILT3在NSCLC組織中的表達(dá)顯著高于癌旁正常肺組織且與病人不良預(yù)后相關(guān)qPCR檢測(cè)結(jié)果示大部分(20/28)NSCLC組織中ILT3mRNA的表達(dá)水平顯著高于配對(duì)的周?chē)７谓M織；免疫組化結(jié)果亦顯示ILT3在原發(fā)性NSCLC腫瘤細(xì)胞中高表達(dá),陽(yáng)性表達(dá)率為66.4%(75/113),且ILT3的表達(dá)與原發(fā)腫瘤大小(p=0.026)、細(xì)胞低分化(p=0.039)、血管浸潤(rùn)(p=0.027)及TNM分期(p=0.018)等臨床病理參數(shù)呈顯著正相關(guān)；高表達(dá)ILT3組患者的瘤內(nèi)微血管密度顯著高于低表達(dá)組；且高表達(dá)ILT3組患者的5年生存率顯著低于低表達(dá)組。2.ILT3促進(jìn)NSCLC細(xì)胞遷移侵襲qPCR和Western blot結(jié)果示：ILT3在所檢測(cè)的6株NSCLC細(xì)胞系(A549、H226、H520、H1299、H1650及H1975)中均存在表達(dá),其中H1650、H1299及H1975屬低表達(dá)細(xì)胞系,而A549、H226和H520為高表達(dá)細(xì)胞系。過(guò)表達(dá)ILT3后,H1650和H1299細(xì)胞的遷移侵襲能力顯著增強(qiáng)；干擾ILT3表達(dá)后,A549和H226細(xì)胞的遷移侵襲能力受到明顯抑制；然而,ILT3對(duì)NSCLC細(xì)胞的增殖和抗凋亡能力無(wú)顯著影響。3.ILT3促進(jìn)NSCLC細(xì)胞體內(nèi)轉(zhuǎn)移裸鼠尾靜脈注射轉(zhuǎn)移模型的結(jié)果顯示：過(guò)表達(dá)ILT3的H1650細(xì)胞在裸鼠肺組織形成轉(zhuǎn)移灶的數(shù)目較對(duì)照組顯著增多,提示ILT3可促進(jìn)NSCLC細(xì)胞在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移。4.ILT3通過(guò)激活ERK和PI3K-Akt通路促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的遷移侵襲Western blot結(jié)果顯示：上調(diào)ILT3表達(dá)后,H1650細(xì)胞中MAPK和PI3K-Akt通路中的關(guān)鍵蛋白ERK和Akt的磷酸化水平顯著升高；而干擾ILT3表達(dá)后,A549細(xì)胞中ERK和Akt的磷酸化水平明顯下降。隨后,H1650細(xì)胞轉(zhuǎn)染ILT3過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后再加入ERK通路抑制劑U0126或PI3K-Akt通路抑制劑LY294002處理,細(xì)胞的遷移侵襲能力均受到明顯抑制。5.ILT3促進(jìn)NSCLC細(xì)胞發(fā)生不完全EMTWestern blot結(jié)果顯示：上調(diào)ILT3表達(dá)后,H1650細(xì)胞中vimentin的表達(dá)水平明顯升高,而E-cadherin的表達(dá)無(wú)明顯變化；干擾ILT3表達(dá)后,A549細(xì)胞中vimentin的表達(dá)水平顯著下調(diào),而E-cadherin的表達(dá)亦無(wú)明顯變化。6.ILT3上調(diào)血管生成相關(guān)因子VEGF-A和FGF1的表達(dá)并增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞的成管能力。因免疫組化分析結(jié)果提示ILT3可促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移,且與瘤內(nèi)微血管密度相關(guān),于是我們檢測(cè)了ILT3對(duì)經(jīng)典的促血管生成因子VEGF-A和FGF1表達(dá)的影響。Western blot結(jié)果示：上調(diào)ILT3表達(dá)后,H1650細(xì)胞中VEGF-A和FGF1的表達(dá)水平明顯升高；而干擾ILT3表達(dá)后,A549細(xì)胞中VEGF-A和FGF1的表達(dá)水平明顯降低。在H1650細(xì)胞轉(zhuǎn)染ILT3過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后加入ERK信號(hào)通路抑制劑U0126或PI3K-Akt通路抑制劑LY294002,ILT3對(duì)VEGF-A和FGF1的上調(diào)作用均受到明顯抑制。此外我們收集過(guò)表達(dá)ILT3的H1650細(xì)胞和干擾ILT3表達(dá)的A549細(xì)胞及各自對(duì)照細(xì)胞的培養(yǎng)上清做為條件培養(yǎng)基培養(yǎng)HUVEC,觀察其成管能力和細(xì)胞內(nèi)ERK1/2及PI3K-Akt通路的活化情況。小管形成實(shí)驗(yàn)示：H1650細(xì)胞過(guò)表達(dá)ILT3后,其培養(yǎng)上清可增強(qiáng)]IUVEC的成管能力；而干擾ILT3表達(dá)的A549細(xì)胞的培養(yǎng)上清培養(yǎng)的HUVEC的成管能力減弱。Western blot結(jié)果示：過(guò)表達(dá)ILT3的H1650細(xì)胞的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的HUVEC內(nèi)ERKI/2和Akt的磷酸化水平顯著高于對(duì)照組,而干擾ILT3表達(dá)的A549細(xì)胞的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的HUVEC內(nèi)pERK和pAkt的水平明顯低于對(duì)照組。7.FGF1在NSCLC組織中表達(dá)的臨床病理意義FGF1在NSCLC組織中高表達(dá),且其表達(dá)水平與原發(fā)腫瘤大小、組織學(xué)類(lèi)型和血管浸潤(rùn)相關(guān)。肺鱗癌中FGF1的表達(dá)水平顯著高于肺腺癌,在鱗癌和腺癌亞組內(nèi)FGF1的表達(dá)與微血管密度呈正相關(guān)。在肺鱗癌亞組內(nèi),FGF1高表達(dá)與預(yù)后不良相關(guān),但在肺腺癌亞組內(nèi)FGF1高表達(dá)與預(yù)后生存無(wú)顯著相關(guān)性。結(jié)論1.ILT3在人NSCLC組織內(nèi)高表達(dá),且腫瘤細(xì)胞內(nèi)ILT3的表達(dá)與NSCLC病人預(yù)后不良相關(guān),可用于判斷預(yù)后。體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)ILT3可促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的遷移侵襲能力。2.ILT3可通過(guò)ERK和PI3K-Akt信號(hào)通路上調(diào)血管生成相關(guān)因子VEGF-A和FGF1的表達(dá),并促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的小管形成能力。3.FGF1在NSCLC組織中高表達(dá),且肺鱗癌中FGF1的表達(dá)水平顯著高于肺腺癌,在肺鱗癌亞組內(nèi)FGF1高表達(dá)與預(yù)后不良相關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R734.2

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 王琪 ,安利佳 ,陳譽(yù)華 ,岳世昌;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP94在人肺癌組織中的表達(dá)及其意義(英文)[J];Chinese Medical Journal;2002年11期

2 張東明;趙達(dá);何積銀;;肺癌和癌旁正常肺組織中5種腫瘤標(biāo)志物比較研究[J];內(nèi)科;2007年02期

3 沈慶;李華;蘭四友;蔣幼凡;熊剛;;肺癌組織中α_(1,3) FUCT Ⅶ mRNA的表達(dá)及其與轉(zhuǎn)移的關(guān)系[J];重慶醫(yī)學(xué);2010年11期

4 賈晉偉;郭述良;錢(qián)桂生;黃桂君;;AnnexinⅡ基因在肺癌組織中的表達(dá)分析[J];中華肺部疾病雜志(電子版);2010年04期

5 李勞冬;莫碧文;于會(huì)娜;王昌明;曾錦榮;王績(jī)英;韋江紅;黃劍偉;;Musashi1和Sox2蛋白在肺癌組織中的表達(dá)及其臨床意義[J];吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2014年01期

6 許凝,孫兵,李繼良;核糖核酸酶抑制因子在肺癌中的表達(dá)[J];中國(guó)誤診學(xué)雜志;2005年03期

7 張華;張明月;王洲;劉相燕;陳鋼;劉凡英;;腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表達(dá)與Ⅰ期非小細(xì)胞肺癌預(yù)后的相關(guān)性[J];腫瘤;2010年10期

8 蘭四友;蔣幼凡;;肺癌組織中NF-κB-p65 mRNA與CD15s蛋白的表達(dá)及與細(xì)胞凋亡的關(guān)系[J];環(huán)境與健康雜志;2011年06期

9 成黨校,錢(qián)桂生,金發(fā)光,黃桂君,王建麗;人肺癌組織中單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)泵基因mRNA表達(dá)的變化[J];基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床;2001年05期

10 于涓瀚;韋強(qiáng);齊鳳杰;徐洪濤;王恩華;;窖蛋白-1在肺癌中的表達(dá)及意義[J];中華病理學(xué)雜志;2006年11期

相關(guān)會(huì)議論文 前5條

1 陳愉生;黃麗萍;李鴻茹;王貴清;苗彥;林明;許能鑾;;SDF-1,CXCR4在肺癌組織中的表達(dá)及其與凋亡抑制蛋白基因livin的相關(guān)性初步探討[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)年會(huì)——2013第十四次全國(guó)呼吸病學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2013年

2 于涓瀚;韋強(qiáng);齊鳳杰;徐洪濤;王恩華;;caveolin-1在肺癌中的表達(dá)及意義[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)病理學(xué)分會(huì)2006年學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2006年

3 趙煥芬;何春年;翟金萍;張秀智;李萍;;趨化因子受體CCR7在肺癌組織中的表達(dá)及其臨床意義[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)病理學(xué)分會(huì)2007年學(xué)術(shù)年會(huì)暨第九屆全國(guó)病理大會(huì)論文匯編[C];2007年

4 姜祥寧;張洪玉;龐寶森;張予輝;呂月平;;血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體3與非小細(xì)胞肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第七次全國(guó)呼吸病學(xué)術(shù)會(huì)議暨學(xué)習(xí)班論文匯編[C];2006年

5 楊進(jìn);陸友金;張妍蓓;何鳳蓮;劉榮玉;;肺癌組織中MGMT蛋白的表達(dá)及其與吸煙的關(guān)系[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第七次全國(guó)呼吸病學(xué)術(shù)會(huì)議暨學(xué)習(xí)班論文匯編[C];2006年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前2條

1 李娟;ILT3在非小細(xì)胞肺癌中的作用及分子機(jī)制探究[D];山東大學(xué);2016年

2 王琪;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP94、GRP78和PDI在人體肺癌組織中表達(dá)的研究[D];大連理工大學(xué);2002年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 喬云飛;ATF5在肺癌中的表達(dá)及其臨床意義[D];揚(yáng)州大學(xué);2015年

2 何鳳蓮;TLR4與TLR9在肺癌組織中的表達(dá)及其臨床意義[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2007年

3 孫兵;核糖核酸酶抑制因子在肺癌中的表達(dá)[D];大連醫(yī)科大學(xué);2004年

4 李冠華;miR-155、miR-32基因在肺癌中的突變分析[D];山東大學(xué);2007年

5 蘭四友;NF-κB-p65mRNA與基質(zhì)金屬蛋白酶-1、CD15s蛋白在肺癌組織中的表達(dá)及其與轉(zhuǎn)移的關(guān)系[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2010年

6 戎彪學(xué);Decorin mRNA、p57～（KIP2）mRNA與TGF-β1在肺癌中的表達(dá)及臨床意義[D];蘭州大學(xué);2006年

7 季文萱;肺癌組織中Survivin、Fas/Fasl及P53蛋白的表達(dá)及臨床意義[D];青島大學(xué);2004年

8 張明月;MTA1蛋白表達(dá)與Ⅰ期NSCLC復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及預(yù)后關(guān)系研究[D];山東大學(xué);2009年

9 王儉;Rac1在肺腺、鱗癌中的表達(dá)和意義[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2006年

10 劉化勇;ANG-2、CD105及CD34在NSCLC中的表達(dá)及其與預(yù)后的意義[D];山東大學(xué);2010年

，

本文編號(hào)：2321782