【摘要】：隨著近幾十年來腫瘤免疫學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展和進(jìn)步,人們認(rèn)識(shí)到機(jī)體的免疫狀態(tài)以及腫瘤內(nèi)部免疫微環(huán)境的動(dòng)態(tài)改變存在于腫瘤發(fā)生與發(fā)展的整個(gè)過程。早在20世紀(jì)70年代,即有學(xué)者提出免疫監(jiān)視理論:在正常狀態(tài)下,機(jī)體免疫系統(tǒng)能夠識(shí)別和殺傷異常細(xì)胞,保持正常細(xì)胞增殖和遺傳物質(zhì)的傳遞;當(dāng)機(jī)體免疫功能抑制或異常細(xì)胞演進(jìn)導(dǎo)致免疫系統(tǒng)無法識(shí)別異常細(xì)胞時(shí),異常細(xì)胞增殖可形成腫瘤。21世紀(jì)初期出現(xiàn)的腫瘤免疫編輯學(xué)說是近十幾年來腫瘤免疫研究的背景,其闡述了腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程中大體上經(jīng)歷的三種免疫狀態(tài):清除-平衡-逃逸;認(rèn)為免疫系統(tǒng)與腫瘤細(xì)胞之間是一個(gè)動(dòng)態(tài)的互相改變及被改變的過程。T淋巴細(xì)胞表型和功能的動(dòng)態(tài)改變?cè)谡麄�(gè)過程中起著重要的作用。在免疫逃逸時(shí)相,腫瘤細(xì)胞能夠逃逸T細(xì)胞介導(dǎo)的識(shí)別和殺傷作用,原因在于機(jī)體和腫瘤內(nèi)部存在大量免疫抑制性分子及抑制性T細(xì)胞。免疫治療開啟了腫瘤治療史上新的里程,其針對(duì)對(duì)象和失敗原因均是腫瘤的免疫抑制狀態(tài),特別是腫瘤內(nèi)部微環(huán)境的免疫抑制狀態(tài)。腫瘤微環(huán)境中聚集了大量調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell,T-reg)及髓系來源的抑制性細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cell,MDSC);諸多抑制性分子的高表達(dá)及細(xì)胞因子的異常分泌誘導(dǎo)形成了大量的耗竭性T細(xì)胞,共同構(gòu)筑了抑制性免疫環(huán)境,從而使腫瘤細(xì)胞得以逃逸免疫系統(tǒng)的殺傷。T-reg細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫抑制性細(xì)胞,可抑制細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)、自然殺傷細(xì)胞(natural killer,NK)及樹突狀細(xì)胞(dendritic cell,DC)等多種免疫效應(yīng)細(xì)胞的功能,是腫瘤免疫逃逸的關(guān)鍵因素。T-reg細(xì)胞被腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)募集和增殖,已證實(shí)在多種腫瘤中T-reg細(xì)胞數(shù)量上升,進(jìn)而抑制機(jī)體的抗腫瘤反應(yīng),且T-reg細(xì)胞水平與患者腫瘤進(jìn)展及預(yù)后相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)NSCLC患者腫瘤組織中浸潤(rùn)的T-reg細(xì)胞和外周血中T-reg細(xì)胞比例明顯高于正常人,且T-reg細(xì)胞的浸潤(rùn)比例與腫瘤分期和預(yù)后相關(guān)。然而,在NSCLC患者中,T-reg細(xì)胞表面抑制性分子的表達(dá)水平與腫瘤的關(guān)系尚未見報(bào)道。除T-reg細(xì)胞,MDSC等抑制性細(xì)胞外,機(jī)體和腫瘤內(nèi)部還存在大量失去免疫功能的T細(xì)胞,表現(xiàn)為耗竭性T細(xì)胞,其表面持續(xù)性高表達(dá)抑制性分子或抑制性受體,如細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(cytotoxic T-lymphocyte associated antigen-4,CTLA-4),程序性死亡蛋白1(programmed death-1,PD-1),T細(xì)胞免疫球蛋白和粘蛋白結(jié)構(gòu)3(T cell immunoglobulin and mucin domain-3,TIM-3)等作為免疫檢查點(diǎn)共同調(diào)控著免疫細(xì)胞的功能和增殖凋亡。在正常情況下,免疫檢驗(yàn)點(diǎn)參與維持自身免疫耐受和保護(hù)正常組織免受免疫系統(tǒng)殺傷。在腫瘤患者中,由于長(zhǎng)期不充分接觸有效的腫瘤抗原,淋巴細(xì)胞會(huì)異常表達(dá)某些抑制性分子,從而造成腫瘤特異性T細(xì)胞發(fā)生功能紊亂,導(dǎo)致T細(xì)胞增殖障礙或同時(shí)減少白介素2(interleukin-2,IL-2),干擾素γ(interferon-γ,IFN-γ),腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等細(xì)胞因子的分泌。免疫檢查點(diǎn)蛋白已經(jīng)成為了腫瘤免疫治療的靶點(diǎn),以期逆轉(zhuǎn)腫瘤免疫抑制狀態(tài)。大量的臨床數(shù)據(jù)顯示針對(duì)共抑制信號(hào)的抗體能夠提高腫瘤特異性T細(xì)胞的應(yīng)答。免疫抑制性分子的效應(yīng)發(fā)揮并非是完全獨(dú)立的,同一淋巴細(xì)胞或不同類型淋巴細(xì)胞表面的抑制性分子的功能和表達(dá)相互影響、調(diào)控;下游通路也存在重疊和交叉,相互之間有協(xié)同或拮抗效應(yīng),共同構(gòu)成具有諸多交集的抑制性分子網(wǎng)絡(luò)。在NSCLC患者體內(nèi),CTLA-4,PD-1和TIM-3在不同類型T細(xì)胞表面的表達(dá)水平如何?這三種負(fù)性協(xié)同刺激分子之間存在什么樣的關(guān)系,與患者臨床病理特征關(guān)系如何?其圍手術(shù)期表達(dá)水平如何動(dòng)態(tài)變化?為了初步探討這些問題,我們?cè)O(shè)計(jì)了該研究,包括三部分內(nèi)容:第一部分:應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry,FCM)分別檢測(cè)64例NSCLC患者和18例健康志愿者外周血中CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞及T-reg細(xì)胞表面CTLA-4、PD-1和TIM-3表達(dá)水平,分析其與患者臨床病理特征之間的關(guān)系,以及相關(guān)免疫指標(biāo)之間的相關(guān)性。結(jié)果顯示:NSCLC患者外周血中CD4+比例、CD4+/CD8+比值分別低于健康組,T-reg/CD4+比值、T-reg比例明顯高于健康組。NSCLC患者外周血CD3+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞表面PD-1+、TIM-3+表達(dá)率分別高于健康組;CD8+T細(xì)胞表面CTLA-4+和PD-1+表達(dá)率分別高于健康組;T-reg細(xì)胞表面CTLA-4+和TIM-3+表達(dá)率分別高于健康組。T-reg/CD4+比值和T-reg細(xì)胞表面CTLA-4表達(dá)率與NSCLC患者的TNM分期相關(guān),CD4+T細(xì)胞表面PD-1+和TIM-3+表達(dá)率分別與NSCLC患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)相關(guān)。T-reg/CD4+比值與CD4+T細(xì)胞表面PD-1+表達(dá)率、T-reg細(xì)胞表面CTLA-4+表達(dá)率、T-reg細(xì)胞表面TIM-3+表達(dá)率均顯示正相關(guān);T-reg細(xì)胞表面CTLA-4+表達(dá)率與T-reg細(xì)胞表面TIM-3+表達(dá)率呈正相關(guān),CD8+T細(xì)胞表面的PD-1+表達(dá)率與TIM-3+表達(dá)率呈正相關(guān)。第二部分:采用多色標(biāo)記定量免疫熒光法(multiplex quantitative Immunofluorescent,QIF)檢測(cè)了21例NCSLC患者術(shù)后腫瘤組織中腫瘤浸潤(rùn)T淋巴細(xì)胞表面PD-1和TIM-3的表達(dá)水平,分析PD-1和TIM-3在腫瘤浸潤(rùn)T淋巴細(xì)胞表面共表達(dá)的情況以及這些指標(biāo)與患者臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果顯示,PD-1和TIM-3在NSCLC患者腫瘤浸潤(rùn)T淋巴細(xì)胞表面高表達(dá),且TIM-3和PD-1普遍存在共表達(dá)現(xiàn)象;與本研究第一部分相同患者外周血中CD3+T細(xì)胞表面PD-1+和TIM-3+表達(dá)率相比分別明顯升高;并且CD3+T細(xì)胞表面PD-1+、TIM-3+表達(dá)率在外周血與腫瘤組織中相關(guān);PD-1+TIM-3+T細(xì)胞代表了腫瘤浸潤(rùn)T淋巴細(xì)胞的主要組成部分。CD3+T細(xì)胞表面PD-1+表達(dá)率與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān),CD3+T細(xì)胞表面TIM-3+表達(dá)率和腫塊直徑相關(guān)。PD-1+TIM-3-CD3+T細(xì)胞與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。PD-1+TIM-3+CD3+T細(xì)胞與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及p TNM分期相關(guān)。第三部分:應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)41例可手術(shù)NSCLC患者術(shù)前1天、術(shù)后1天、術(shù)后3天、術(shù)后7天、術(shù)后28天5個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)外周血中CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、T-reg細(xì)胞表面CTLA-4、PD-1和TIM-3的表達(dá)水平,分析不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)共抑制分子表達(dá)水平的變化,并探討其與手術(shù)治療的關(guān)系。結(jié)果顯示:與術(shù)前1d對(duì)比,術(shù)后1d、3d、7d的外周血中CD3+比例、CD4+比例和CD4+/CD8+比值均明顯降低。術(shù)后28d CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞和CD4+/CD8+比值顯著高于術(shù)前。術(shù)后3d CD8+T細(xì)胞水平明顯高于術(shù)前。術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)外周血T-reg/CD3+比值明顯低于手術(shù)前。術(shù)后1d T-reg/CD4+T比例高于手術(shù)前;術(shù)后28d T-reg/CD4+比值明顯低于手術(shù)前。與術(shù)前1d相比,術(shù)后7d、28d CTLA-4在CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、T-reg細(xì)胞表面陽(yáng)性表達(dá)率降低。術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)外周血中PD-1在CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、T-reg細(xì)胞表面陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于手術(shù)前。與術(shù)前1d相比,術(shù)后7d、28d TIM-3在外周血CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、T-reg細(xì)胞表面陽(yáng)性表達(dá)率降低。本文發(fā)現(xiàn)與健康人群相比,NSCLC患者外周血中淋巴細(xì)胞表面CTLA-4和(或)PD-1和(或)TIM-3陽(yáng)性表達(dá)率升高;部分共抑制分子和抑制性細(xì)胞表達(dá)水平的升高與NSCLC患者的TNM分期或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)具有相關(guān)性;提示NSCLC患者整體處于免疫抑制狀態(tài),且外周血中免疫抑制因素可能促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。T-reg細(xì)胞表面TIM-3和CTLA-4的相關(guān)性提示TIM-3也可能是T-reg細(xì)胞的表面標(biāo)記分子;T-reg細(xì)胞可能是參與腫瘤進(jìn)展的重要因素,靶向清除T-reg細(xì)胞可能增強(qiáng)抗腫瘤免疫。腫瘤組織內(nèi)TIM-3和PD-1的共表達(dá)現(xiàn)象揭示了腫瘤局部浸潤(rùn)T淋巴細(xì)胞多為高度耗竭性T細(xì)胞,并且參與腫瘤細(xì)胞免疫逃逸、促進(jìn)疾病進(jìn)展。多色標(biāo)記免疫熒光技術(shù)和多光譜組織成像分析系統(tǒng)的使用有助于深入認(rèn)識(shí)腫瘤免疫抑制網(wǎng)絡(luò),為篩選新靶點(diǎn)和免疫檢查點(diǎn)抑制劑的優(yōu)化應(yīng)用提供依據(jù)。手術(shù)會(huì)短暫抑制機(jī)體免疫功能,也能有效降低共抑制分子的表達(dá),減輕腫瘤源性免疫抑制,術(shù)前及緊隨術(shù)后可能是聯(lián)合使用免疫檢查點(diǎn)抑制劑的合適時(shí)機(jī)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R734.2

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本文編號(hào)：2321578