【摘要】：研究背景和目的隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,人民生活水平的提高,居民飲食結(jié)構(gòu)的改變,結(jié)直腸癌已成為世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的一種消化系統(tǒng)腫瘤。近年來(lái)伴隨科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,結(jié)直腸癌的診療已取得了很大進(jìn)步,然而,其發(fā)病率和死亡率仍較高。目前,結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是導(dǎo)致死亡的主要原因。因此,關(guān)于結(jié)直腸癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究對(duì)于患者的早期篩查、臨床治療和生存預(yù)后都具有十分重要的意義。視黃酸受體γ(RARγ)作為核受體超家族中的一員,其在介導(dǎo)細(xì)胞增殖、分化和凋亡等生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。然而其在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用及調(diào)控機(jī)制尚不清楚。Hippo通路能夠調(diào)控細(xì)胞的增殖和凋亡,其在控制組織器官的發(fā)育以及維持組織器官的大小等方面發(fā)揮著極其重要的作用。近年來(lái)越來(lái)越多的研究表明,Hippo信號(hào)通路的異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展緊密相關(guān)。Yap作為Hippo信號(hào)通路中的關(guān)鍵效應(yīng)分子,其在腫瘤細(xì)胞中異常的表達(dá)及活性會(huì)驅(qū)動(dòng)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移。然而,Hippo-Yap信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在結(jié)直腸癌中的調(diào)控機(jī)制仍有待進(jìn)一步探討,Hippo-Yap信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與核受體之間是否存在某種關(guān)聯(lián)仍有待研究。在本研究中,我們旨在研究視黃酸受體RARγ在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用;闡明RARγ通過(guò)與Hippo-Yap信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的交互作用介導(dǎo)結(jié)直腸癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制;以期明確RARγ/Hippo-Yap信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)新機(jī)制在結(jié)直腸癌中的作用及臨床意義。研究方法1、Western blot檢測(cè)RARγ在人結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)情況;2、免疫組化分析RARγ的表達(dá)量與腫瘤、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移和預(yù)后情況的相關(guān)性;3、利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建穩(wěn)定敲低RARγ的細(xì)胞株,用質(zhì)粒載體構(gòu)建過(guò)表達(dá)RARγ的細(xì)胞株;RARγHippo-Yap4、通過(guò)MTT和平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力的變化;5、使用Transwell細(xì)胞轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)細(xì)胞的遷移和侵襲的能力變化;6、運(yùn)用裸鼠皮下成瘤和肺轉(zhuǎn)移模型研究腫瘤細(xì)胞的體內(nèi)變化;7、利用免疫熒光和細(xì)胞亞組分蛋白分離技術(shù)研究蛋白在細(xì)胞中的定位;8、熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)RARγ對(duì)于Hipoo-Yap信號(hào)通路的作用關(guān)系;9、運(yùn)用RT-PCR的方法檢測(cè)通路下游基因的表達(dá)變化;10、利用免疫共沉淀的方法研究蛋白質(zhì)之間的相互作用;研究?jī)?nèi)容第一節(jié)檢測(cè)RARγ在人臨床結(jié)直腸癌組織標(biāo)本中的表達(dá)對(duì)人結(jié)直腸癌配對(duì)的臨床標(biāo)本組織進(jìn)行Western blot的檢測(cè),發(fā)現(xiàn)其中78%的RARγ高表達(dá)于癌旁組織中;免疫組化的結(jié)果也同樣發(fā)現(xiàn),RARγ在癌旁組織中的表達(dá)高于結(jié)直腸癌組織,并且RARγ在癌組織中的表達(dá)量與結(jié)直腸癌患者的腫瘤體積、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移和預(yù)后優(yōu)良密切相關(guān)。第二節(jié)RARγ的缺失對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞體內(nèi)外生物學(xué)特性的影響構(gòu)建并篩選了穩(wěn)定敲低RARγ的SW480和HT-29細(xì)胞株;MTT的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,穩(wěn)定敲低RARγ的結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480與對(duì)照組細(xì)胞相比體外增殖能力升高;平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,穩(wěn)定敲低RARγ的結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480與對(duì)照組細(xì)胞相比體外形成克隆能力升高;Migration實(shí)驗(yàn)表明,穩(wěn)定敲低RARγ的結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480與對(duì)照組細(xì)胞相比體外遷移能力增加;Invasion實(shí)驗(yàn)表明,穩(wěn)定敲低RARγ的結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480與對(duì)照組細(xì)胞相比體外侵襲能力增加;裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,穩(wěn)定敲低RARγ的結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480與對(duì)照組細(xì)胞相比體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)能力增加;裸鼠肺轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,穩(wěn)定敲低RARγ的結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480與對(duì)照組細(xì)胞相比體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移灶個(gè)數(shù)增加。第三節(jié)RARγ的過(guò)表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞體內(nèi)外生物學(xué)特性的影響構(gòu)建并篩選了穩(wěn)定過(guò)表達(dá)RARγ的DLD-1和RKO細(xì)胞株;平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)RARγ的結(jié)直腸癌細(xì)胞DLD-1和RKO均比對(duì)照組細(xì)胞體外形成克隆數(shù)目減少;Migration實(shí)驗(yàn)表明,過(guò)表達(dá)RARγ的結(jié)直腸癌細(xì)胞DLD-1和RKO均比對(duì)照組細(xì)胞體外遷移能力下降;Invasion實(shí)驗(yàn)表明,過(guò)表達(dá)RARγ的結(jié)直腸RARγHippo-Yap癌細(xì)胞DLD-1與對(duì)照組細(xì)胞相比體外侵襲能力下降;裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,穩(wěn)定過(guò)表達(dá)RARγ的結(jié)直腸癌細(xì)胞DLD-1與對(duì)照組細(xì)胞相比體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)能降低;裸鼠肺轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,穩(wěn)定過(guò)表達(dá)RARγ的結(jié)直腸癌細(xì)胞DLD-1與對(duì)照組細(xì)胞相比體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移灶個(gè)數(shù)下降。第四節(jié)RARγ通過(guò)改變Yap蛋白的磷酸化進(jìn)而影響結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移Western blot結(jié)果顯示,穩(wěn)定敲低RARγ的人結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480和HT-29中Yap的磷酸化水平降低;反之,過(guò)表達(dá)RARγ的人結(jié)直腸癌細(xì)胞DLD-1和RKO中Yap的磷酸化水平升高;穩(wěn)定敲低RARγ的細(xì)胞SW480形成的裸鼠皮下瘤中Yap的磷酸化水平低于對(duì)照組細(xì)胞形成的皮下瘤;RARγ對(duì)Yap磷酸化的改變受到ATRA的調(diào)節(jié);免疫熒光、免疫組化和細(xì)胞亞組分的分離等三個(gè)實(shí)驗(yàn)都提示,在穩(wěn)定敲低RARγ的SW480細(xì)胞中Yap更多的定位于細(xì)胞核;熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)的結(jié)果顯示,在SW480和RKO兩種腫瘤細(xì)胞中過(guò)表達(dá)RARγ會(huì)降低Yap-TEAD的轉(zhuǎn)錄活性;相比之下,在SW480中敲低RARγ會(huì)升高Yap-TEAD的轉(zhuǎn)錄活性;RT-PCR的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在穩(wěn)定敲低RARγ的SW480細(xì)胞中,Hippo通路下游的基因AREG和CTGF都有顯著地上調(diào)表達(dá)。第五節(jié)RARγ通過(guò)依賴Yap的途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換(EMT)過(guò)程RT-PCR和Western blot的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,相比于對(duì)照組細(xì)胞,穩(wěn)定敲低RARγ的SW480細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)下調(diào),Vimentin表達(dá)上調(diào);反之,在過(guò)表達(dá)RARγ的DLD-1細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)上調(diào),Vimentin表達(dá)下調(diào);Western blot也檢測(cè)到同時(shí)干擾Yap后,上述結(jié)果會(huì)出現(xiàn)進(jìn)一步的顯著改變;Migration結(jié)果顯示,穩(wěn)定敲低RARγ的SW480細(xì)胞再同時(shí)干擾Yap會(huì)降低由于RARγ缺失引起的細(xì)胞遷移;Invasion結(jié)果顯示,穩(wěn)定敲低RARγ的SW480細(xì)胞再同時(shí)干擾Yap也會(huì)降低由于RARγ缺失引起的細(xì)胞侵襲。第六節(jié)RARγ能夠與Yap發(fā)生相互作用免疫熒光結(jié)果顯示,高表達(dá)RARγ的結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW480和HCT116中RARγ也存在于細(xì)胞質(zhì)之中;免疫共沉淀和免疫熒光實(shí)驗(yàn)表明,無(wú)論是內(nèi)源性還是外源性的RARγ和Yap都會(huì)相互作用,并且這種相互作用受到ATRA的調(diào)節(jié);通過(guò)RARγ和Yap的缺失突變體的研究表明,RARγ蛋白質(zhì)中的LBD段結(jié)構(gòu)域和RARγHippo-Yap Yap蛋白質(zhì)中102-263的氨基酸段是兩者的結(jié)合區(qū)域;RARγ引起的Yap磷酸化升高是因?yàn)镽ARγ能夠促進(jìn)Lats1與Yap相互作用,進(jìn)而上調(diào)Yap的磷酸化。第七節(jié)腫瘤組織中RARγ的表達(dá)與E-cadherin呈現(xiàn)正相關(guān),與Vimentin和CTGF呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)通過(guò)Spearman秩相關(guān)分析RARγ、E-cadherin、Vimentin和CTGF在人結(jié)直腸癌臨床組織標(biāo)本中的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn),RARγ的表達(dá)與E-cadherin呈現(xiàn)正相關(guān),與Vimentin和CTGF呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.34

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本文編號(hào)：2321276