【摘要】：目的：胃癌是當今社會常見的消化道惡性腫瘤,其發(fā)病率及死亡率呈逐漸上升的趨勢。目前,國內進展期胃癌5年生存率相對較低,不足30%。其主要原因是在治療過程中,胃癌細胞對臨床使用的化療藥物產(chǎn)生較強大的耐藥性,治療效果不佳。腫瘤細胞的多藥耐藥(multidrug resistance,MDR)是導致化療失敗的根本原因。隨著現(xiàn)代醫(yī)學技術的發(fā)展,國內外學者廣泛認為P-糖蛋白抑制劑可以逆轉腫瘤的耐藥性；藥物漢防己堿Tet能夠逆轉腫瘤細胞的多藥耐藥(MDR),但作用機制尚需進一步研究。緩釋氟尿嘧啶植入劑能夠提高化療藥物的局部濃度,增加化療效應,減少不良反應的發(fā)生。本實驗我們將采用熒光定量RT-PCR法、免疫組化技術,研究探討漢防己堿聯(lián)合植入用緩釋氟尿嘧啶對胃癌細胞原位移植小鼠腫瘤細胞的抑制作用,為臨床胃癌的個體化治療及腫瘤細胞多藥耐藥MDR逆轉提供實驗及理論依據(jù)。方法：1動物模型采用胃癌腫瘤細胞原位移植方法進行復制。復蘇的MFC細胞進行傳代培養(yǎng),選擇生長良好的腫瘤細胞種植到615小鼠后背的皮下,進行逐次傳代,6次傳代以后,再將腫瘤實體瘤塊種植到615小鼠的胃壁表面,這樣50只615小鼠原位移植胃癌模型就予以成功建立。250只615小鼠胃癌細胞原位移植成功造模以后,隨機分成五組,每組10只小鼠。造模成功以后,開始給予實驗藥物干預。對照組：生理鹽水腹腔注射；5-氟尿嘧啶組(5-FU組)：給予實驗干預藥物5-氟尿嘧啶,劑量50mg/Kg,給藥方式腹腔注射,頻率每6天給藥一次；漢防己堿組(Tet組)：實驗干預藥物漢防己堿,劑量15mg/Kg,給藥方式腹腔注射,頻率每3天給藥一次；植入用緩釋氟尿嘧啶組(FSRI組)：實驗干預藥物植入用緩釋氟尿嘧啶,劑量6mmg/只,給藥方式瘤旁植入縫合切口,頻率給藥一次；漢防己堿+植入用緩釋氟尿嘧啶組(Tet+FSRI組)：實驗干預藥物漢防己堿+植入用緩釋氟尿嘧啶劑量及給藥方式漢防己堿15mg/Kg進行腹腔注射,同時手術切開腫瘤處皮膚,腫瘤旁植入植入用緩釋氟尿嘧啶,劑量6mmg/只,頻率漢防己堿每3天給藥一次,植入用緩釋氟尿嘧啶給藥一次。三周以后,稱重腫瘤結節(jié)重量,瘤重抑制率=(對照組的平均瘤重一實驗組的平均瘤重)／對照組的平均瘤重×100%。3采用熒光定量RT-PCR方法檢測各組胃癌組織MDR1、Survivin mRNA的表達。4采用免疫組織化學法檢測各組(對照組、5-FU組、Tet組、FSRI組和Tet+FSRI組)胃癌組織P-gp、Survivin蛋白的表達。5用SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)士標準差(x±s)表示,計量資料先進行方差齊性檢驗后,行單因素方差分析(One-Way ANOVE),用SNK法進行兩兩比較,免疫組織化學陽性率比較采用X2檢驗的方法,P0.05才為有統(tǒng)計學意義。方法：1復制615小鼠皮下移植瘤及原位移植瘤模型將小鼠前胃癌細胞株MFC皮下移植第一代2只615小鼠,于小鼠背部接種MFC細胞懸液,待腫瘤逐漸增大至10mm直徑時,進行傳代。取傳代六次后的皮下移植瘤組織實塊,進行小鼠原位移植。大約8-9天后,原位移植動物小鼠模型左上腹部可觸及大約直徑約4mm左右的硬結,提示原位移植瘤造模成功。50只小鼠全部造模成功。2各組前胃癌細胞原位移植615小鼠的行為狀況變化差別比較對照組,615小鼠隨著移植瘤結節(jié)的逐漸增大,其精神越來越差,進食、水逐漸減少,體重逐漸減輕,活動減少,反應遲鈍,存在惡液質表現(xiàn)。5-Fu組、Tet組及FSRI組,發(fā)現(xiàn)各組小鼠均有不同程度的食欲減退、體重減輕、活動減少、反應遲鈍等表現(xiàn)。而Tet+FSRI組,該組小鼠相對其他實驗組小鼠相比,一般情況相對較好,正常進食水,伴有輕度嘔吐,體重無明顯變化,反應較靈敏等表現(xiàn)。3各組原位移植小鼠移植瘤體積的比較實驗結束取瘤時對照組,5-FU組、Tet組、FSRI組、Tet+FSRI組小鼠的體積分別為881.50±59.57mm3,701.80±87.18mm3,399.40± 67.53mm3, 342.60±50.45 mm3,89.60±13.11 mm3;5組比較有統(tǒng)計學差異(P0.05)。5-FU組、Tet組、FSRI組平均腫瘤體積大小顯著小于對照組(P0.05),Tet組及FSRI組平均腫瘤體積大小則無明顯差異性,但均明顯低于5-FU組(P0.05)。Tet+FSRI組平均腫瘤體積最小(P0.05)。4移植瘤的形態(tài)學特點腫瘤呈實體表現(xiàn),表面凹凸不平,包膜不光滑,與周圍組織界限不清。對照組,原位移植瘤的瘤體切面呈灰白色,中央瘤體未見明顯壞死；在光學顯微鏡下可以觀察到散在斑點狀壞死病灶。5-FU、Tet組、FSRI組、Tet+FSRI組,原位移植瘤的瘤體切面也呈灰白色,沒有光澤,中央瘤體能看到大小不等的散在壞死灶,邊緣部位可發(fā)現(xiàn)散在的殘余腫瘤。光學顯微鏡下,瘤體中心發(fā)現(xiàn)大片細胞壞死的表現(xiàn),其內殘留部分可見尚木完全壞死的腫瘤細胞。細胞體積大小不等,細胞核多見異型改變。5各組小鼠移植瘤瘤重及瘤重抑制率的比較實驗結束后取瘤時對照組,5-FU組、Tet組、FSRI組、Tet+FSRI組的瘤重分別為2.16±0.12g,1.93±0.35g,1.86±0.24g,1.84±0.17g,1.27±0.21g；5-FU組、Tet組、FSRI組、Tet+FSRI組瘤重抑制率分別為10.64%,13.88%,14.81%,41.20%;5-FU組、Tet組、FSRI組平均瘤重明顯小于對照組(P0.05),而Tet組及FSRI組平均瘤重則無明顯差異性,但是均明顯低于5-FU組(P0.05)。Tet+FSRI組平均瘤重最低(P0.05)。6 MDR1基因的mRNA在5組原位移植小鼠實驗動物模型中的表達水平實驗結果明確顯示,在5組原位移植小鼠實驗動物模型中MDR1mRNA的表達存在明顯差異性。在Control組中MDR1 mRNA的相對表達水平為1.0404±0.0562；在5-FU組中相對表達水平為3.4404±0.6827；在Tet組表達水平為0.5414±0.0270；在FSRI組表達水平2.3210士0.1982；在Tet+FSRI組表達水平為1.8454±0.3006。5組實驗動物的MDR1 mRNA表達水平比較差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。MDR1 mRNA的表達在5組由強到弱的順序為5-FU組、FSRI組、Tet+FSRI組、Control組、Tet組。7 Survivin基因的mRNA在5組原位移植小鼠實驗動物模型中的表達水平實驗結果明確顯示,在5組原位移植小鼠實驗動物模型中Survivin mRNA的表達存在明顯差異性。在Control組中Survivin mRNA的相對表達水平為1.0544±0.1442；在5-FU組中相對表達與水平為3.3746±0.4746；在Tet組表達水平為0.5360±0.0623；在FSRI組表達水平2.4096±0.1164；在Tet+FSRI組表達水平為1.868±0.3814。5組實驗動物的Survivin mRNA表達水平比較差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。Survivin mRNA的表達在5組由強到弱的順序為5-FU組、FSRI組、Tet+FSRI組、Control組、Tet組。8 P-gp蛋白在5組原位移植小鼠實驗動物模型中的表達水平實驗結果明確顯示,在5組原位移植小鼠實驗動物模型中P-gp蛋白的表達存在明顯差異性。在Control組中P-gp蛋白的相對表達率為1.0404±0.0562；在5-FU組中陽性表達率為3.4404±0.6827；在Tet組陽性表達率為0.5414+0.0270；在FSRI組陽性表達率為2.3210±0.1982；在Tet+FSRI組陽性表達率為1.8454±0.3006。5組實驗動物的P-gp蛋白的表達比較差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。P-gp蛋白的表達在5組由強到弱的順序為5-FU組、FSRI組、Tet+FSRI組、Control組、Tet組。9 Survivin蛋白在5組原位移植小鼠實驗動物模型中的表達水平實驗結果明確顯示,在5組原位移植小鼠實驗動物模型中Survivin蛋白的表達存在明顯差異性。在Control組中Survivin蛋白的陽性表達率為1.0544±0.1442；在5-FU組中陽性表達率為3.3746±0.4746；在Tet組陽性表達率為0.5360±0.0623；在FSRI組陽性表達率2.4096±0.1164；在Tet+FSRI組陽性表達率為1.868±0.3814。5組實驗動物的Survivin蛋白的陽性表達比較差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。Survivin蛋白的表達在5組由強到弱的順序依次為5-FU組、FSRI組、Tet+FSRI組、Control組、Tet組。結論：1漢防己堿聯(lián)合植入用緩釋氟尿嘧啶能夠改善胃癌小鼠的一般狀況(包括精神、食欲、體重、活動及機體反應等情況)。2漢防己堿聯(lián)合植入用緩釋氟尿嘧啶能夠有效抑制腫瘤細胞的生長。3漢防己堿聯(lián)合植入用緩釋氟尿嘧啶能夠明顯降低腫瘤組織MDR1 /P-gp及Survivin mRNA的表達。4漢防己堿聯(lián)合植入用緩釋氟尿嘧啶能夠明顯降低腫瘤組織P-gp及Survivin蛋白的陽性表達,有效逆轉MDR。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.2

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本文編號：2320454