【摘要】：博來霉素(Bleomycin,BLM)是一種氨基糖苷類天然產物,由梅澤賓夫等于1966年從輪枝鏈霉菌的培養(yǎng)液分離得到,至今臨床應用已經50余年,抗癌活性強,尤其對淋巴癌、磷狀細胞癌、肺癌和生殖系統(tǒng)癌癥具有很好的療效,同時無明顯的骨髓抑制,不抑制機體的免疫功能,使其成為臨床腫瘤化療的重要藥物,但其嚴重的肺纖維化毒副作用,極大的限制了臨床足量足療程應用。因此如何在保證BLM足量足療程應用的基礎上,防治肺纖維化是進一步改善腫瘤患者預后的關鍵。整合素連接激酶(integrin-linked kinase,ILK)是運用酵母雙雜交技術鑒定獲得的一種具有蛋白激酶活性的新蛋白質,在多種生長因子信號通路中發(fā)揮重要作用,活化后的ILK可以調控其下游的靶標蛋白,進而調控細胞增殖、生長、分化、遷移、浸潤以及腫瘤血管生成等過程。上皮細胞-間質轉化(epitelial-mesenchymal transition,EMT)是肺纖維化的重要過程,多項研究表明ILK與細胞的EMT密切關聯(lián),促進EMT發(fā)生發(fā)展�；罨蟮腎LK介導α-平滑肌蛋白表達上調,從而參與EMT的形成。新近研究發(fā)現(xiàn)Wnt信號通路同樣可以參與多器官的纖維化過程。Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)信號轉導系統(tǒng)是肺部發(fā)育所必需的分子信號系統(tǒng),其表達異常與肺纖維化亦密切相關,該通路參與纖維化主要與β-連環(huán)蛋白的核聚集相關。當β-catenin磷酸化被抑制時,導致其無法被泛素識別,從而不能被蛋白酶復合體降解,進而在細胞質內大量集聚并發(fā)生核聚集,導致組織纖維化。新近研究發(fā)現(xiàn)β-catenin與ILK存在重要對話:β-catenin的核聚集與糖原合成激酶3β(Gkycogen synthase kinase-3beta,GSK-3β)的磷酸化有關,同時Virchows等研究表明,活化后的ILK亦可以影響GSK-3β的磷酸化,因此二者在肺纖維化中可能存在協(xié)同作用。肺纖維化是一種進行性加重的間質性肺部病變,病理表現(xiàn)為彌漫性肺泡炎、肺泡單位結構紊亂和肺纖維化,其確切發(fā)病機制仍不清楚。大致為化學或其他原因觸發(fā)肺部炎癥,隨后出現(xiàn)滲出、纖維母細胞增殖以及細胞外基質蛋白沉積,最終導致不可逆性肺損傷,目前雖然仍無特性藥物治療,但國內外一個重大突破發(fā)現(xiàn),大環(huán)內酯類抗生素能夠阻止纖維化疾病發(fā)展,甚至可以改善肺功能。何坤等研究發(fā)現(xiàn),紅霉素可以預防博來霉素導致的肺纖維化。牛曉娟等研究發(fā)現(xiàn)阿奇霉素能夠減輕肺纖維化大鼠模型中膠原沉積,具有與地塞米松相似的作用,且不良反應少。但大環(huán)內酯類抗生素抗纖維化的具體機制仍處于探索之中。目的:本文通過博來霉素復制小鼠肺纖維化模型,予阿奇霉素干預,觀察小鼠肺組織病理改變及ILK和β-catenin含量變化,探討阿奇霉素在肺纖維化中的作用,并為臨床應用提供理論依據(jù)。方法:選取清潔級健康昆明小鼠100只,體重18-22g,適應性飼養(yǎng)1周后,隨機分為A組(模型組):20只,氣管內一次性注入BLM(3.5mg/Kg,以1ml生理鹽水溶解),于造模后第1天生理鹽水1ml灌胃,1次/d,共28天;B組(空白組):20只,氣管內注入1ml生理鹽水,于假造模后第1天生理鹽水1ml灌胃,1次/d,共28天。C組(阿奇霉素干預組Ⅰ):20只,氣管內一次性注入BLM(3.5mg/Kg,以1ml生理鹽水溶解),于造模后第1天給予阿奇霉素5mg/Kg(1ml生理鹽水溶解)灌胃,1次/天,共14天。D組(阿奇霉素干預組Ⅱ):20只,氣管內一次性注入BLM(3.5mg/Kg,以1ml生理鹽水溶解),于造模后第15天給予阿奇霉素5mg/Kg(1ml生理鹽水溶解)灌胃,1次/天,共14天。E組(阿奇霉素干預組Ⅲ):20只,氣管內一次性注入BLM(3.5mg/Kg,以1ml生理鹽水溶解),于造模后第1天給予阿奇霉素5mg/Kg(1ml生理鹽水溶解)灌胃,1次/天,共28天。以上各組分別于7、14、21、28天各處死5只。剪斷右側股動脈放血處死,處死后即刻取右肺勻漿,置于-70℃冰箱中,待標本收集完成后,運用ELISA測定ILK、β-catenin蛋白含量。左肺組織放于4%甲醛固定液后做HE染色及Masson染色,評價肺泡炎癥和肺纖維化的程度。統(tǒng)計學分析:應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件包對實驗數(shù)據(jù)進行處理,計數(shù)資料采用均數(shù)±標準差(X±SD)表示,同一時間點,同一指標的組間比較在滿足正態(tài)性及方差齊性下進行獨立樣本T檢驗,不滿足正態(tài)性或方差齊性情況下進行獨立樣本的非參數(shù)檢驗,兩變量相關采用Spearman等級相關分析,以P0.05為檢驗標準。結果:1肺組織病理結果分析:在相同時間點,A組小鼠肺泡炎及纖維化程度均顯著高于B組;C組和E組小鼠肺均有輕度肺泡炎及纖維化,兩組與A組比較,小鼠肺泡炎及纖維化程度均顯著減輕;D組小鼠肺組織實驗第7天及第14天可見與A組相同時間點同樣程度的肺泡炎癥及纖維化,給予阿奇霉素干預后,即第21天及第28天D組小鼠肺組織炎癥及纖維化較A組相同時間點明顯減輕。各組病理結果表明肺纖維化分為早期炎癥及晚期纖維化兩個階段,符合人肺纖維化病理過程,且炎癥反應隨纖維化進展逐漸減輕,而纖維化程度逐漸加重。2肺組織中ILK、β-catenin含量:2.1組間比較1)相同時間點:A組小鼠肺組織中的ILK、β-catenin含量較B組均明顯升高,尤以A組第28天升高最為顯著,差異均有統(tǒng)計學意義(P均0.05);2)相同時間點:C組小鼠肺組織中的ILK、β-catenin含量較A組均明顯降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P均0.05);3)相同時間點:D組小鼠肺組織中ILK、β-catenin含量在第7天、第14天較A組無明顯變化,差異均無統(tǒng)計學意義(P均0.05);在第21天、第28天肺組織中ILK、β-catenin含量較A組均明顯下降,差異均有統(tǒng)計學意義(P均0.05);4)相同時間點:E組小鼠肺組織中ILK、β-catenin含量較A組均明顯下降,差異均有統(tǒng)計學意義(P均0.05);5)相同時間點:C組小鼠肺組織中ILK、β-catenin含量較E組均無明顯變化,差異均無統(tǒng)計學意義;2.2組內比較1)不同時間點:A組小鼠肺組織中ILK、β-catenin含量隨時間延長逐漸增加,差異均有統(tǒng)計學意義(P均0.05);2)不同時間點:B、C、E三組中,小鼠肺組織ILK、β-catenin含量均無明顯變化,差異均無統(tǒng)計學意義(P均0.05);3)不同時間點:D組小鼠肺組織中ILK、β-catenin含量在阿奇霉素干預前后均有差異,即D組小鼠肺組織ILK、β-catenin含量在第7天、第14天與第21天、28天比較均明顯降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P均0.05)。3肺組織中ILK、β-catenin的相關性分析:不同時間點A組博來霉素模型組中,小鼠肺組織ILK、β-catenin的含量較B組空白組小鼠肺組織ILK、β-catenin的含量均明顯升高,二者呈正性相關,具有統(tǒng)計數(shù)意義(P0.001,r=0.978)結論:1阿奇霉素可以阻斷博來霉素致小鼠肺纖維化發(fā)生、進展,可能成為臨床解決腫瘤患者應用博來霉素致肺纖維化的防治方法。2阿奇霉素干預小鼠肺纖維化的效果與用藥時機及藥物療程有關,于肺纖維化早期炎癥階段效果顯著,對小鼠肺纖維化后期纖維化階段也存在一定效果。3 ILK、β-catenin均參與肺纖維化過程,二者存在正性相關,提示二者在纖維化過程中可能存在協(xié)同作用。
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【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R730.5

【參考文獻】

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本文編號：2317067