【摘要】：肺癌是發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤,大部分的肺癌患者到了晚期才被發(fā)現(xiàn)。早期發(fā)現(xiàn)并加以干預(yù)可提高肺癌患者的生存時(shí)間,因而臨床亟需尋找一種具有較高敏感度和特異度的診斷方法。近年來(lái)有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iRNA可以作為非小細(xì)胞肺癌的一個(gè)潛在的診斷標(biāo)志物,本研究旨在發(fā)現(xiàn)血清中異常表達(dá)的miRNA并能夠用以輔助診斷,另外,我們對(duì)其中一個(gè)miRNA, miR-660進(jìn)行了進(jìn)一步的功能研究。我們選取了44例非小細(xì)胞肺癌患者和22例正常對(duì)照血清樣本用以篩選非小細(xì)胞肺癌患者中異常表達(dá)的miRNA,另外我們選取了300例血清樣本,包括178例非小細(xì)胞肺癌患者和122例正常對(duì)照用來(lái)對(duì)發(fā)現(xiàn)的miRNA進(jìn)行驗(yàn)證。這300例樣本按照肺癌和正常對(duì)照分別隨機(jī)分為兩組,一組作為訓(xùn)練組用來(lái)建立miRNA的診斷模型,一組作為驗(yàn)證組用來(lái)驗(yàn)證診斷模型。在發(fā)現(xiàn)階段,我們選取了380個(gè)miRNA,通過TaqMan(?) miRNA ABC Purification試劑盒進(jìn)行了miRNA的提取,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法對(duì)miRNA的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-194、miR-652和miR-660在非小細(xì)胞肺癌患者血清中高表達(dá),并且其中的一個(gè)miRNA、miR-660在20對(duì)非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)水平也高于相應(yīng)的癌旁組織,可以推測(cè)血清miR-660可能來(lái)源于肺癌組織。在發(fā)現(xiàn)階段,3個(gè)miRNA (miR-194、miR-652和miR-660)被證實(shí)在非小細(xì)胞肺癌患者血清中高表達(dá),之后通過大樣本的驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)miR-652和miR-660在肺腺癌和肺鱗癌中表達(dá)水平都有一定的提高(p0.01)。之后我們通過ROC曲線對(duì)miR-652和miR-660的診斷效率進(jìn)行了評(píng)價(jià),結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-652在訓(xùn)練組和驗(yàn)證組的曲線下面積分別為0.819(95% CI：0.749-0.877)和0.819(95% CI：0.747-0.877),miR-660的曲線下面積為：訓(xùn)練組：0.735(95% CI：0.657-0.803)；驗(yàn)證組：0.714(95% CI：0.634-0.785)。由于單個(gè)的miRNA的診斷效率還不是很高,我們將miR-652和miR-660通過二元logistic回歸方程進(jìn)行了組合,結(jié)果發(fā)現(xiàn)組合后的模型對(duì)非小細(xì)胞肺癌(肺腺癌和肺鱗癌)的診斷效率要優(yōu)于單獨(dú)的miR-660的診斷效率(p0.05)。在此基礎(chǔ)上,我們將該組合和臨床使用的腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行了比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-652和miR-660的組合在訓(xùn)練組和驗(yàn)證組中對(duì)非小細(xì)胞肺癌(肺腺癌和肺鱗癌)的診斷效率均要優(yōu)于CEA和CA125(p0.05)。然而,Cyfra21-1對(duì)非小細(xì)胞肺癌(肺腺癌和肺鱗癌)的診斷效率與miR-652+miR-660的組合相差無(wú)幾。因此,我們將miR-652+miR-660與這三個(gè)腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行了隨機(jī)組合并計(jì)算了各個(gè)組合對(duì)非小細(xì)胞肺癌(肺腺癌和肺鱗癌)的診斷效率,結(jié)果發(fā)現(xiàn)niR-652+miR-660+Cyfra21-1為最優(yōu)組合,該組合能夠顯著提高肺腺癌的診斷效率,訓(xùn)練組的曲線下面積為0.941(95% CI：0.881-0.977),驗(yàn)證組的曲線下面積為0.942(95% CI：0.881-0.977)。但是對(duì)于肺鱗癌,miR-652+miR-660+Cyfra21-1組合的診斷效率依然和Cyfra21-1沒有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。由于miR-660在非小細(xì)胞肺癌中的功能研究甚少,我們選擇了miR-660進(jìn)行進(jìn)一步的功能學(xué)研究,通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-660的抑制劑,發(fā)現(xiàn)miR-660表達(dá)水平的降低能夠抑制肺癌細(xì)胞系A(chǔ)nip973的侵襲、遷移和增殖能力。抑制miR-660的表達(dá)水平能夠誘導(dǎo)細(xì)胞周期G2/M的阻滯進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖。之后我們使用生物信息學(xué)方法對(duì)miR-660的下游靶基因進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)PCDH9的3'UTR可以和miR-660的種子序列互補(bǔ)結(jié)合。PCDH9是原鈣粘蛋白超家族的一個(gè)成員,其在不同的腫瘤組織中的表達(dá)水平均低于癌旁組織。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌組織中miR-660水平的降低會(huì)導(dǎo)致PCDH9的表達(dá)水平的升高,即miR-660和PCDH9的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。以上結(jié)果說(shuō)明miR-660的表達(dá)水平升高能夠通過抑制PCDH9的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。綜上所述,miR-652+miR-660+Cyfra21-1的組合可以作為非小細(xì)胞肺癌的一個(gè)新的標(biāo)志物用于肺癌的輔助診斷,尤其對(duì)肺腺癌的診斷效率更好。其中miR-660可能會(huì)通過影響PCDH9蛋白的表達(dá)來(lái)影響細(xì)胞的表型,說(shuō)明miR-660可能在肺癌的發(fā)展中發(fā)揮重要的作用,可以對(duì)其進(jìn)行更為深入的研究。
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【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R734.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2315600