【摘要】：肺癌是發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤,大部分的肺癌患者到了晚期才被發(fā)現(xiàn)。早期發(fā)現(xiàn)并加以干預可提高肺癌患者的生存時間,因而臨床亟需尋找一種具有較高敏感度和特異度的診斷方法。近年來有文獻報道m(xù)iRNA可以作為非小細胞肺癌的一個潛在的診斷標志物,本研究旨在發(fā)現(xiàn)血清中異常表達的miRNA并能夠用以輔助診斷,另外,我們對其中一個miRNA, miR-660進行了進一步的功能研究。我們選取了44例非小細胞肺癌患者和22例正常對照血清樣本用以篩選非小細胞肺癌患者中異常表達的miRNA,另外我們選取了300例血清樣本,包括178例非小細胞肺癌患者和122例正常對照用來對發(fā)現(xiàn)的miRNA進行驗證。這300例樣本按照肺癌和正常對照分別隨機分為兩組,一組作為訓練組用來建立miRNA的診斷模型,一組作為驗證組用來驗證診斷模型。在發(fā)現(xiàn)階段,我們選取了380個miRNA,通過TaqMan(?) miRNA ABC Purification試劑盒進行了miRNA的提取,采用實時熒光定量PCR的方法對miRNA的表達水平進行了檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-194、miR-652和miR-660在非小細胞肺癌患者血清中高表達,并且其中的一個miRNA、miR-660在20對非小細胞肺癌組織中的表達水平也高于相應的癌旁組織,可以推測血清miR-660可能來源于肺癌組織。在發(fā)現(xiàn)階段,3個miRNA (miR-194、miR-652和miR-660)被證實在非小細胞肺癌患者血清中高表達,之后通過大樣本的驗證發(fā)現(xiàn)miR-652和miR-660在肺腺癌和肺鱗癌中表達水平都有一定的提高(p0.01)。之后我們通過ROC曲線對miR-652和miR-660的診斷效率進行了評價,結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-652在訓練組和驗證組的曲線下面積分別為0.819(95% CI：0.749-0.877)和0.819(95% CI：0.747-0.877),miR-660的曲線下面積為：訓練組：0.735(95% CI：0.657-0.803)；驗證組：0.714(95% CI：0.634-0.785)。由于單個的miRNA的診斷效率還不是很高,我們將miR-652和miR-660通過二元logistic回歸方程進行了組合,結(jié)果發(fā)現(xiàn)組合后的模型對非小細胞肺癌(肺腺癌和肺鱗癌)的診斷效率要優(yōu)于單獨的miR-660的診斷效率(p0.05)。在此基礎(chǔ)上,我們將該組合和臨床使用的腫瘤標志物進行了比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-652和miR-660的組合在訓練組和驗證組中對非小細胞肺癌(肺腺癌和肺鱗癌)的診斷效率均要優(yōu)于CEA和CA125(p0.05)。然而,Cyfra21-1對非小細胞肺癌(肺腺癌和肺鱗癌)的診斷效率與miR-652+miR-660的組合相差無幾。因此,我們將miR-652+miR-660與這三個腫瘤標志物進行了隨機組合并計算了各個組合對非小細胞肺癌(肺腺癌和肺鱗癌)的診斷效率,結(jié)果發(fā)現(xiàn)niR-652+miR-660+Cyfra21-1為最優(yōu)組合,該組合能夠顯著提高肺腺癌的診斷效率,訓練組的曲線下面積為0.941(95% CI：0.881-0.977),驗證組的曲線下面積為0.942(95% CI：0.881-0.977)。但是對于肺鱗癌,miR-652+miR-660+Cyfra21-1組合的診斷效率依然和Cyfra21-1沒有顯著的統(tǒng)計學差異。由于miR-660在非小細胞肺癌中的功能研究甚少,我們選擇了miR-660進行進一步的功能學研究,通過瞬時轉(zhuǎn)染miR-660的抑制劑,發(fā)現(xiàn)miR-660表達水平的降低能夠抑制肺癌細胞系A(chǔ)nip973的侵襲、遷移和增殖能力。抑制miR-660的表達水平能夠誘導細胞周期G2/M的阻滯進而影響細胞的增殖。之后我們使用生物信息學方法對miR-660的下游靶基因進行了分析,發(fā)現(xiàn)PCDH9的3'UTR可以和miR-660的種子序列互補結(jié)合。PCDH9是原鈣粘蛋白超家族的一個成員,其在不同的腫瘤組織中的表達水平均低于癌旁組織。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)非小細胞肺癌組織中miR-660水平的降低會導致PCDH9的表達水平的升高,即miR-660和PCDH9的表達水平呈負相關(guān)。以上結(jié)果說明miR-660的表達水平升高能夠通過抑制PCDH9的表達進而促進非小細胞肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力。綜上所述,miR-652+miR-660+Cyfra21-1的組合可以作為非小細胞肺癌的一個新的標志物用于肺癌的輔助診斷,尤其對肺腺癌的診斷效率更好。其中miR-660可能會通過影響PCDH9蛋白的表達來影響細胞的表型,說明miR-660可能在肺癌的發(fā)展中發(fā)揮重要的作用,可以對其進行更為深入的研究。
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【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R734.2

【參考文獻】

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本文編號：2315600