發(fā)布時(shí)間：2018-11-03 14:34

【摘要】：目的:通過(guò)對(duì)永生化人支氣管上皮細(xì)胞(BEAS-2B)進(jìn)行體外香煙煙霧染毒,建立惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞模型。通過(guò)檢測(cè)BEAS-2B細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中組蛋白H3K9乙酰化水平及部分相關(guān)抑癌基因mRNA表達(dá)水平的改變,探索吸煙致肺癌的發(fā)生機(jī)制,并為吸煙致肺癌的防治及早期分子標(biāo)志物的篩查提供理論依據(jù)。方法:BEAS-2B細(xì)胞用LHC-8培養(yǎng)基于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),0.25%胰酶消化處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以1.5×105個(gè)/皿接種于Transwell培養(yǎng)皿中,培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后將Transwell培養(yǎng)皿置于細(xì)胞氣體染毒裝置中,Transwell膜上方持續(xù)泵入香煙煙霧直接對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染毒,膜下方通入培養(yǎng)基保持細(xì)胞濕潤(rùn),染毒裝置內(nèi)氧氣濃度恒定于21%,水浴維持染毒腔溫度恒定于37℃,每次同時(shí)染毒3個(gè)Transwell培養(yǎng)皿。通過(guò)CCK-8法檢測(cè)不同香煙煙霧濃度以及不同時(shí)間后的細(xì)胞增殖抑制率,確定合適的染煙濃度與時(shí)間以進(jìn)行長(zhǎng)期連續(xù)染毒。染煙兩次后將Transwell培養(yǎng)皿中的細(xì)胞消化,種于培養(yǎng)皿中常規(guī)培養(yǎng),待生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后收集細(xì)胞,取部分細(xì)胞繼續(xù)下一次染煙,其余常規(guī)培養(yǎng)及傳代,細(xì)胞連續(xù)染煙兩次作為染煙一代,共染煙30代,傳代40代。對(duì)照組細(xì)胞暴露于煙霧濃度為0%的相同裝置中,其余條件同染毒組。分別檢測(cè)對(duì)照組和染煙第1代、10代、20代、30代細(xì)胞及各自傳代40代后其周期、凋亡率、ROS水平以及軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的情況。通過(guò)ChIP-seq來(lái)高通量檢測(cè)對(duì)照組和染煙30代傳代40代組細(xì)胞之間組蛋白H3K9乙酰化差異改變位點(diǎn)。用熒光定量PCR檢測(cè)對(duì)照組及各染煙組細(xì)胞MGMT、P21WAF1、FHIT、RARβ、PTEN基因mRNA表達(dá)情況。通過(guò)CCK-8法確定組蛋白去乙�；敢种苿┣乓志谹(TSA)的作用濃度及時(shí)間,熒光定量PCR檢測(cè)對(duì)照組及Sm20-40和Sm30-40組細(xì)胞TSA作用前后MGMT、P21WAF1、FHIT、RARβ、PTEN基因mRNA表達(dá)情況。結(jié)果:(1)cck-8結(jié)果:根據(jù)cck-8結(jié)果顯示,在染煙時(shí)間相同的條件下,隨著染煙濃度的升高,細(xì)胞增殖抑制率逐漸上升;在煙霧濃度相同的條件下,隨著染煙時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞增殖抑制率逐漸上升,最終確定以香煙煙霧濃度為20%,每次染煙10分鐘作為細(xì)胞長(zhǎng)期連續(xù)染煙的條件,在此條件下,染煙后細(xì)胞增殖抑制率在40%左右。(2)基礎(chǔ)指標(biāo)檢測(cè):beas-2b細(xì)胞經(jīng)香煙煙霧持續(xù)染毒10代并傳代至40代后已出現(xiàn)形態(tài)學(xué)改變,異形性細(xì)胞增多,細(xì)胞呈復(fù)層重疊生長(zhǎng),隨著染煙及傳代代數(shù)的增加,細(xì)胞形態(tài)學(xué)和生長(zhǎng)趨于穩(wěn)定,與癌細(xì)胞的生長(zhǎng)特性相類似。與對(duì)照組相比,各染煙祖細(xì)胞g1期比例均有所降低(p0.05),s期細(xì)胞比例均有所上升(p0.05),染煙組細(xì)胞傳代后凋亡率均較染煙初期明顯降低,同時(shí),染煙組細(xì)胞內(nèi)ros水平均較對(duì)照組細(xì)胞明顯上升,且隨著染煙代數(shù)的增加而增加。(3)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化程度改變:對(duì)照組細(xì)胞在軟瓊脂中克隆形成能力較弱,克隆形成率在1.7%左右,且克隆體積較小,但隨著染煙代數(shù)的增加以及傳代,細(xì)胞克隆形成能力逐漸增強(qiáng),克隆形成率增加,且克隆體積較大,染煙30代傳代至40代的細(xì)胞克隆形成率最高,可達(dá)30%以上(p0.05)。(4)高通量檢測(cè)組蛋白乙�；町愇稽c(diǎn):通過(guò)對(duì)chip-seq的結(jié)果分析,與對(duì)照組相比,染煙組細(xì)胞共檢測(cè)到155個(gè)基因啟動(dòng)子區(qū)組蛋白h3k9乙酰化水平升高,892個(gè)基因啟動(dòng)子區(qū)組蛋白h3k9乙�；浇档汀�(5)基因表達(dá)改變:選擇了一些基因進(jìn)行mrna表達(dá)檢測(cè)驗(yàn)證與分析。qpcr結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,染煙組細(xì)胞mgmt、p21waf1、fhit、rarβ、pten基因mrna表達(dá)水平均降低;通過(guò)cck-8法確定給予細(xì)胞75nmol/l曲古抑菌素a(tsa)作用24h后,對(duì)照組細(xì)胞5種基因mrna表達(dá)水平較tsa作用前無(wú)明顯變化,染煙組細(xì)胞fhit、rarβ基因mrna表達(dá)水平較tsa作用前也無(wú)明顯改變,而mgmt、p21waf1、pten基因mrna表達(dá)水平較tsa作用前明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。結(jié)論:1.建立了體外香煙煙霧染毒誘發(fā)beas-2b細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化模型,且確認(rèn)了細(xì)胞惡性程度隨著染煙代數(shù)及傳代代數(shù)的增加而呈劑量效應(yīng)關(guān)系。2.篩選出了在細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中組蛋白h3k9乙�；町愇稽c(diǎn),在細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中,mgmt、fhit、p21waf1、rarβ、pten基因表達(dá)均降低,其中fhit、rarβ基因表達(dá)改變不受組蛋白乙�；揎椀挠绊�,mgmt、p21waf1基因表達(dá)改變主要受組蛋白乙�；揎椀恼{(diào)控,而PTEN基因的表達(dá)改變部分歸因于組蛋白乙酰化修飾,證明了組蛋白乙�；揎棇�(duì)部分基因的表達(dá)起到了調(diào)控作用,為吸煙致肺癌的防治及早期分子生物標(biāo)志物的篩查提供了理論依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R734.2

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