【摘要】：[目的]下咽癌占下咽原發(fā)惡性腫瘤的95%,屬于頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(HNSCC),多發(fā)生于梨狀窩區(qū),位置隱匿。是上消化呼吸道惡性程度最高的腫瘤之一,近年來(lái)發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。由于其癥狀不明顯,易被混淆和忽視,所以患者被確診時(shí)大都已中晚期。如何徹底清除癌腫,同時(shí)保留功能,減少?gòu)?fù)發(fā),提高生存率,一直是臨床醫(yī)生探索的方向。納米金(Nano gold)指金的微小顆粒,制備一定尺寸且可控縱橫比的納米金棒就能夠允許以一個(gè)相當(dāng)直接的方式剪裁它們的光學(xué)性質(zhì)。當(dāng)制備納米金棒的縱橫比為3.9時(shí),800nm波長(zhǎng)的近紅外光照射可以引起棒表層導(dǎo)帶電子發(fā)生相干最大震蕩,此即為表面等離子共振現(xiàn)象(surface plasmon resonance,SPR),吸收的光能轉(zhuǎn)換成大量的熱,這些瞬間產(chǎn)生的熱量足夠有效地摧毀腫瘤細(xì)胞而不會(huì)損傷周圍的正常細(xì)胞組織,從而達(dá)到細(xì)胞水平殺滅腫瘤細(xì)胞的目的,這就是等離子體共振光熱治療(Plasmonic photothermal therapy,PPTT)的理論基礎(chǔ)。80%-90%的頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(HNSCC)的患者已被證實(shí)為EGFR過(guò)度表達(dá)。目前,EGFR單抗(EGFR-mAb)作為Au-NRs常用的功能化修飾物被大量研究。眾多的實(shí)驗(yàn)研究表明,這種穩(wěn)定結(jié)合后的EGFR-mAb/GNRs共軛物可以選擇性地結(jié)合在高表達(dá)EGFR的頭頸鱗癌細(xì)胞膜上而使其具有靶向性。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用近紅外激光對(duì)富集于下咽癌腫瘤細(xì)胞的EGFR單克隆抗體修飾的納米金棒進(jìn)行激發(fā),驗(yàn)證光熱效應(yīng)靶向誘導(dǎo)下咽癌腫瘤細(xì)胞凋亡,并在PI3K/Akt途徑下探討近紅外激光激發(fā)下納米金棒誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制。我們從以下幾個(gè)方面進(jìn)行研究:① 觀察mAb-EGFR功能化修飾的納米金棒在下咽癌FaDu腫瘤細(xì)胞中的聚集及納米金棒與腫瘤細(xì)胞的相互作用;②檢測(cè)納米金棒對(duì)于下咽癌腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性,并以未表達(dá)EGFR的非腫瘤細(xì)胞293T作為對(duì)照;③檢測(cè)mAb-EGFR功能化修飾的納米金棒誘導(dǎo)下咽癌FaDu腫瘤細(xì)胞凋亡;④探討PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路在mAb-EGFR/AuNRs光熱誘導(dǎo)下咽癌FaDu細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制。[方法]實(shí)驗(yàn)采用縱橫比約為3.9的納米金棒,將其表面修飾表皮生長(zhǎng)因子受體單克隆抗體(Epidermal growth factor receptor monoclonal antibody,mAb-EGFR),在波長(zhǎng)808nm的近紅外激光的照射下,利用納米金棒的等離子共振效應(yīng)誘導(dǎo)人下癌FaDu細(xì)胞凋亡。第一部分:mAb-EGFR功能化修飾的納米金棒與腫瘤細(xì)胞和非腫瘤細(xì)胞的相互作用,探索體外實(shí)驗(yàn)中納米金棒濃度,共聚焦顯微鏡觀察納米金棒在細(xì)胞中的聚集,納米金棒與FaDu細(xì)胞作用的細(xì)胞毒性分析(LDH法)及光熱效應(yīng)的溫度變化分析。第二部分:mAb-EGFR功能化修飾的納米金棒光熱效應(yīng)誘導(dǎo)人咽癌FaDu細(xì)胞凋亡。驗(yàn)證mAb-EGFR功能化修飾的納米金棒在波長(zhǎng)808nm的近紅外激光的照射下,等離子共振效應(yīng)誘導(dǎo)人下咽癌FaDu細(xì)胞凋亡;采用AnexinV-PI染色法,流式細(xì)胞儀,ELISA法,熒光顯微鏡觀察FaDu腫瘤細(xì)胞的凋亡情況。第三部分:在PI3K/Akt信號(hào)途徑和DNA損傷通路下探討納米金棒在近紅外激光光熱誘導(dǎo)FaDu細(xì)胞凋亡的機(jī)制,實(shí)驗(yàn)采用Western Blot免疫印跡法和Q-PCR法分析PI3K/Akt信號(hào)通路途徑上Akt,PTEN,P53等因子的變化趨勢(shì)和可能的細(xì)胞凋亡機(jī)制,在體外實(shí)驗(yàn)中探索新型的靶向治療因子。各實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用對(duì)比研究方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。[結(jié)果]1、mAb-EGFR功能化修飾的納米金棒進(jìn)入FaDu細(xì)胞的數(shù)量明顯多于未經(jīng)修飾的納米金棒進(jìn)入FaDu細(xì)胞的數(shù)量,并且納米金棒聚集于胞漿,甚至可以進(jìn)入細(xì)胞核。對(duì)于293T細(xì)胞,mAb-EGFR功能化修飾的納米金棒進(jìn)入細(xì)胞的數(shù)量明顯低于未經(jīng)修飾的納米金棒。說(shuō)明mAb-EGFR功能化修飾的納米金棒對(duì)于FaDu細(xì)胞具有一定靶向性。2、加入相同體積(濃度為15%-25%)的mAb-EGFR/Au+NIR組比較,納米金棒對(duì)于FaDu腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性高于293T細(xì)胞(P0.01)。對(duì)于293T細(xì)胞相同體積(濃度為15%-25%)的Au+NIR組比較,mAb-EGFR/Au+NIR組的細(xì)胞毒性明顯降低(P0.01)。3、用均數(shù)說(shuō)明未經(jīng)mAb-EGFR功能化修飾的納米金棒對(duì)于下咽癌FaDu細(xì)胞和非腫瘤細(xì)胞293T細(xì)胞在近紅外激光的照射下也表現(xiàn)為照射時(shí)間越長(zhǎng),溫度越高(P0.01)。并且相同劑量條件下mAb-EGFR功能化修飾的納米金棒對(duì)于下咽癌FaDu細(xì)胞和非腫瘤細(xì)胞293T細(xì)胞在近紅外激光的照射下與未經(jīng)mAb-EGFR功能化修飾的納米金棒相比較產(chǎn)熱溫度更高(P0.01)。4、AnnexinV/PI 流式細(xì)胞儀,Tunel 法及 Western Blot 檢測(cè) Bal-2、Bax、Caspase3和Caspase9均顯示mAb-EGFR功能化修飾的納米金棒在近紅外激光下誘導(dǎo)下咽癌FaDu細(xì)胞發(fā)生凋亡。5、Q-PCR和Western Blot法檢測(cè)PI3K信號(hào)通路和DNA損傷通路中各因子,mAb-EGFR/Au+NIR組的總AKT與其余各組沒(méi)有出現(xiàn)明顯的改變,但是對(duì)于P-AKT-S473 和 P-AKT-T308,表達(dá)出現(xiàn)了 明顯的降低;PI3K、GSK3β 在mAb-EGFR/Au+NIR、Au+NIR和mAb-EGFR/Au、Au處理因素下呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì);P-PTEN 在 mAb-EGFR/Au+NIR、mAb-EGFR/Au、EGFR 處理因素下有上升趨勢(shì);在DNA損傷通路中,P53各個(gè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比較有明顯上升;ATR、P-CHK1 和 P-CHK2 在 mAb-EGFR/Au+NIR、mAb-EGFR/Au、EGFR 處理因素下逐漸上升;P-PDK1在EGFR和mAb-EGFR/Au處理因素中有上升趨勢(shì),但是在mAb-EGFR/Au+NIR組中表達(dá)降低。[結(jié)論]1、mAb-EGFR功能化修飾的納米金棒能夠進(jìn)入到人下咽癌FaDu細(xì)胞中。2、當(dāng)納米金棒的吸光度OD值約為1.3時(shí),濃度為15%-25%的納米金棒溶液能夠有效殺傷下咽癌細(xì)胞而對(duì)非腫瘤細(xì)胞損傷較小。3、體外實(shí)驗(yàn)中,對(duì)近紅外激光對(duì)納米金棒作用的細(xì)胞照射時(shí)間為6分鐘。4、mAb-EGFR功能化修飾納米金棒近紅外激光誘導(dǎo)使人咽部鱗癌FaDu腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。5、mAb-EGFR功能化修飾納米金棒近紅外激光誘導(dǎo)下,阻斷了 AKT的磷酸化,從而使PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路失活,阻止了細(xì)胞DNA的修復(fù),誘導(dǎo)人咽部鱗癌FaDu腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R739.63

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2307282