【摘要】：【目的】膠質(zhì)瘤是最常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性腫瘤,約占原發(fā)性腦腫瘤的60%-70%。膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)部位特殊,手術(shù)不易全切,且對(duì)放療、化療均不敏感,故術(shù)后復(fù)發(fā)率高,常規(guī)治療效果不佳;而惡性膠質(zhì)瘤(如膠質(zhì)母細(xì)胞瘤)預(yù)后更差,半數(shù)生存期不足一年。快速增殖和廣泛遷移侵襲是惡性膠質(zhì)瘤的重要生物學(xué)特征,同時(shí)也是多基因、多通路調(diào)控異常的結(jié)果。葡萄球菌核酸酶結(jié)構(gòu)域包含蛋白1(SND1)是一種進(jìn)化上較為保守的蛋白,其可作為多通路的協(xié)同轉(zhuǎn)錄激活因子,并對(duì)RNA代謝起重要調(diào)節(jié)作用。最新研究顯示SND1在多種常見(jiàn)惡性腫瘤細(xì)胞(如乳腺癌、結(jié)腸癌等)中過(guò)表達(dá),提示其功能異常活躍可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。但是,膠質(zhì)瘤細(xì)胞中SND1表達(dá)水平是否異常,該異常與腫瘤良惡性級(jí)別有何關(guān)系,由此引發(fā)的SND1功能紊亂在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及其機(jī)制如何,目前尚不清楚。本研究采用人膠質(zhì)瘤組織學(xué)標(biāo)本及膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U87MG及U251對(duì)上述問(wèn)題進(jìn)行了深入探討。【方法】1.采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)147例不同級(jí)別膠質(zhì)瘤組織和20例非腫瘤對(duì)照腦組織SND1、RHOA、MMP2及Ki-67抗原的表達(dá)水平;結(jié)合TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù),分析SND1、RHOA及MMP2表達(dá)水平之間的關(guān)系;結(jié)合臨床隨訪資料,分析SND1、RHOA、MMP2表達(dá)水平與患者總體和無(wú)癥狀生存期之間的關(guān)系。2.通過(guò)慢病毒感染建立穩(wěn)定沉默SND1的U87MG和U251亞細(xì)胞系(SND1-sh)和穩(wěn)定表達(dá)無(wú)義序列的對(duì)照亞細(xì)胞系(scramble),同時(shí)用SND1真核表達(dá)質(zhì)粒和空載體分別轉(zhuǎn)染U87MG和U251細(xì)胞(SND1組及pSG5組),并以非轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為空白對(duì)照(mock);采用Western blot檢測(cè)以上各組細(xì)胞中SND1的表達(dá)水平;采用MTT及克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各亞細(xì)胞系和mock組細(xì)胞的增殖活性以及U251和其亞細(xì)胞系的克隆形成效率(CFE),采用transwell體外遷移侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞的遷移侵襲能力,以明確不同SND1表達(dá)水平對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞上述生物學(xué)行為的影響。3.利用qRT-PCR及Western blot檢測(cè)上述各組細(xì)胞SND1、RHOA及MMP2mRNA及蛋白表達(dá)水平,以明確SND1對(duì)RHOA和MMP2表達(dá)的調(diào)控作用;采用染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)以及凝膠遷移率實(shí)驗(yàn)(EMSA),在U87MG及U251中驗(yàn)證snd1是否通過(guò)轉(zhuǎn)錄激活調(diào)控的方式上調(diào)rhoa和mmp2的表達(dá)。4.分別采用流式細(xì)胞術(shù)(fcm)和westernblot檢測(cè)u87mg及u251細(xì)胞系及其snd1-sh和scramble亞細(xì)胞系細(xì)胞周期分布及關(guān)鍵周期素、周期素依賴(lài)激酶及其抑制因子的表達(dá)水平,明確敲低snd1對(duì)腫瘤細(xì)胞細(xì)胞周期分布和增殖的影響;分別利用rhoa特異性小干擾rna(rhoa-si)及其對(duì)照無(wú)義序列(scramble)與snd1真核表達(dá)質(zhì)粒(snd1)及其空載(psg5)共轉(zhuǎn)染u87mg及u251細(xì)胞系建立rhoa-si/snd1組、scramble/snd1組、rhoa-si/psg5組及scramble/psg5組,通過(guò)mtt檢測(cè)各組細(xì)胞增殖活性,通過(guò)westernblot檢測(cè)各組snd1、rhoa及關(guān)鍵周期素、周期素依賴(lài)激酶及其抑制因子的表達(dá)水平,以明確snd1促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞細(xì)胞周期進(jìn)展及增殖的分子機(jī)制。5.分別利用mmp-2特異性小干擾rna(mmp2-si)及其對(duì)照無(wú)義序列(scramble)與snd1真核表達(dá)質(zhì)粒(snd1)及其空載(psg5)共轉(zhuǎn)染u87mg及u251細(xì)胞系建立mmp2-si/snd1組、scramble/snd1組、mmp2/psg5組及scramble/psg5組,通過(guò)體外遷移侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞遷移侵襲能力,通過(guò)westernblot檢測(cè)各組snd1、rhoa、mmp2表達(dá)水平。6.利用westernblot檢測(cè)snd1-sh和scramble亞細(xì)胞系及mock組細(xì)胞mmp-2、c-jun、磷酸化c-jun(p-c-jun)水平;檢測(cè)rhoa-si/snd1組、scramble/snd1組、rhoa-si/psg5組和scramble/psg5組細(xì)胞遷移侵襲能力及c-jun、p-c-jun和mmp2的水平,以明確snd1促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移侵襲的分子機(jī)制。【結(jié)果】1.免疫組化結(jié)果顯示,各膠質(zhì)瘤組snd1、rhoa、mmp2及ki-67陽(yáng)性標(biāo)記指數(shù)(li%)均明顯高于非腫瘤對(duì)照腦組織,并均隨腫瘤的良惡性級(jí)別的升高而升高,各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05~0.001)。相關(guān)分析顯示,snd1li%與ki-67、rhoa及mmp2li%均呈顯著性正相關(guān)(r=0.959~0.984,p0.001),這與tcga數(shù)據(jù)分析結(jié)果相同。kaplan-meier生存分析證實(shí),snd1、rhoa及mmp2高表達(dá)患者的無(wú)癥狀生存時(shí)間和總生存時(shí)間均低于低表達(dá)患者(p0.0001);cox回歸分析顯示,snd1、rhoa及mmp2過(guò)表達(dá)均為影響患者生存時(shí)間的風(fēng)險(xiǎn)因素,其中snd1li%為患者無(wú)癥狀和總生存時(shí)間的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。2.westernblot檢測(cè)結(jié)果顯示,各snd1-sh亞細(xì)胞系的snd1表達(dá)水平均低于相應(yīng)的mock組、psg5組及scramble亞細(xì)胞系,證實(shí)穩(wěn)定敲低snd1表達(dá)的u87mg及u251亞細(xì)胞株及其無(wú)義對(duì)照序列亞細(xì)胞株構(gòu)建成功,且snd1真核表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染可提高轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)snd1的表達(dá)水平。3.mtt檢測(cè)結(jié)果顯示,從體外培養(yǎng)4~5d起,snd1-sh亞細(xì)胞系的增殖活性明顯低于mock組和scramble亞細(xì)胞系(p0.05~0.01),u251-snd1-sh亞細(xì)胞系的cfe亦明顯低于各對(duì)照(亞)細(xì)胞系(p0.001),證實(shí)敲低snd1表達(dá)可抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖活性。體外遷移侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí),各snd1-sh亞細(xì)胞系的遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)均明顯低于相應(yīng)的scramble亞細(xì)胞系及mock和psg5組細(xì)胞(p0.05~0.01),而snd1組則明顯高于以上各組(p0.05~0.01),證實(shí)敲低snd1可有效抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的遷移侵襲,而轉(zhuǎn)染外源性snd1可明顯提高腫瘤細(xì)胞的遷移侵襲能力。4.qrt-pcr和westernblot結(jié)果顯示,各snd1-sh亞細(xì)胞系snd1、rhoa及mmp2mrna及蛋白的表達(dá)水平均明顯低于相應(yīng)的scramble亞細(xì)胞系及mock和psg5組細(xì)胞(p0.001),而snd1組三種mrna及蛋白的表達(dá)水平均明顯高于其它組(p0.001),證實(shí)敲低/過(guò)表達(dá)snd1可有效抑制/提高膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞內(nèi)源性rhoa及mmp2mrna和蛋白的表達(dá)。chip及emsa實(shí)驗(yàn)顯示snd1可特異性結(jié)合于rhoa及mmp2編碼基因的啟動(dòng)子區(qū),證實(shí)snd1可作為轉(zhuǎn)錄共激活因子通過(guò)誘導(dǎo)rhoa及mmp2mrna的轉(zhuǎn)錄提高其蛋白的表達(dá)水平。5.fcm結(jié)果顯示,snd1-sh亞細(xì)胞系g0/g1期細(xì)胞比例明顯高于mock組及scramble亞細(xì)胞系,證實(shí)敲低snd1可通過(guò)誘導(dǎo)g1期阻滯抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖。westernblot結(jié)果顯示snd1-sh亞細(xì)胞系ccnd1(cyclind1)、ccne1(cycline1)及cdk4表達(dá)水平降低,而cdkn1b(p27kip1)水平升高。共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:rhoa特異性sirna可在不改變細(xì)胞內(nèi)snd1表達(dá)水平的條件下模擬敲低snd1對(duì)ccnd1、ccne1及cdkn1b表達(dá)的影響;過(guò)表達(dá)snd1可在上調(diào)rhoa的同時(shí)上調(diào)ccnd1、ccne1、cdk4,并下調(diào)cdkn1b的表達(dá)水平,且該效應(yīng)可被rhoa特異性sirna完全逆轉(zhuǎn)。以上結(jié)果證實(shí),snd1通過(guò)誘導(dǎo)rhoa,實(shí)現(xiàn)對(duì)g1/s轉(zhuǎn)換關(guān)鍵周期素、周期素依賴(lài)性激酶及其抑制因子的調(diào)控,從而加速細(xì)胞周期進(jìn)展,促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖。6.體外遷移侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,mmp2特異性sirna可在不影響snd1及rhoa表達(dá)的條件下模擬敲低snd1對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞遷移侵襲的影響;過(guò)表達(dá)snd1可促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的遷移侵襲,該效應(yīng)可被mmp2特異性sirna完全逆轉(zhuǎn)。以上結(jié)果證實(shí)snd1可通過(guò)上調(diào)mmp2促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移侵襲。7.SND1-sh亞細(xì)胞系c-Jun表達(dá)水平與相應(yīng)mock組及scramble亞細(xì)胞系無(wú)顯著差異,但其p-c-Jun水平明顯低于后者,證實(shí)敲低SND1可抑制c-Jun的磷酸化。共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:RHOA特異性siRNA可模擬敲低SND1對(duì)c-Jun磷酸化的影響并下調(diào)MMP-2的表達(dá),抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的遷移侵襲;過(guò)表達(dá)SND1可在上調(diào)RHOA表達(dá)的同時(shí)促進(jìn)c-Jun的磷酸化和MMP-2表達(dá),并促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的遷移侵襲,且該效應(yīng)可被RHOA特異性siRNA逆轉(zhuǎn)。以上結(jié)果證實(shí),通過(guò)誘導(dǎo)RHOA表達(dá)提高RHOA/JNK/c-Jun通路的活性是SND1上調(diào)MMP2并促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移侵襲的另一重要分子通路�！窘Y(jié)論】1.膠質(zhì)瘤細(xì)胞普遍存在SND1、RHOA及MMP2的異常高表達(dá),三者的表達(dá)水平隨膠質(zhì)瘤良惡性級(jí)別的升高而升高,故其陽(yáng)性標(biāo)記指數(shù)均可作為評(píng)價(jià)膠質(zhì)瘤良惡性級(jí)別的輔助指標(biāo)。膠質(zhì)瘤細(xì)胞SND1、RHOA及MMP2表達(dá)水平均與患者生存時(shí)間密切相關(guān),其中,SND1表達(dá)水平可作為患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。2.在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中SND1是RHOA和MMP2表達(dá)的重要調(diào)控因子,SND1可直接結(jié)合于RHOA和MMP2基因的啟動(dòng)子區(qū),并作為轉(zhuǎn)錄共激活因子誘導(dǎo)RHOA和MMP2 mRNA的轉(zhuǎn)錄,從而提高內(nèi)源性RHOA和MMP2的表達(dá)水平。3.RHOA是SND1調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的重要靶點(diǎn)。SND1可通過(guò)上調(diào)RHOA提高腫瘤細(xì)胞cyclin D1、cyclin E1及CDK4的表達(dá)水平,并抑制p27Kip1的表達(dá),從而加速G1/S轉(zhuǎn)換,促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖。4.MMP2是SND1調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移侵襲的重要靶點(diǎn)。SND1不僅可直接上調(diào)MMP2,還可通過(guò)激活RHOA/JNK/c-Jun通路誘導(dǎo)MMP2表達(dá),并最終提高膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移侵襲能力。5.SND1表達(dá)異常升高是導(dǎo)致膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展的重要原因,亦是膠質(zhì)瘤細(xì)胞獲得無(wú)限增殖和活躍遷移侵襲能力的重要分子機(jī)制。靶向沉默SND1表達(dá)可通過(guò)抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和遷移侵襲發(fā)揮膠質(zhì)瘤抑瘤作用,有可能成為對(duì)惡性膠質(zhì)瘤進(jìn)行有效干預(yù)的重要策略。此外,敲低RHOA及MMP2亦可發(fā)揮明確的膠質(zhì)瘤抑瘤作用,故亦可作為惡性膠質(zhì)瘤分子干預(yù)的有用靶點(diǎn)。6.本研究采用的慢病毒載體可有效感染膠質(zhì)瘤細(xì)胞并敲低SND1表達(dá),為沉默SND1提供了有效的技術(shù)手段。研究過(guò)程中建立的穩(wěn)定敲低SND1的U87MG和U251亞細(xì)胞系和對(duì)照亞細(xì)胞系為進(jìn)一步研究SND1對(duì)膠質(zhì)瘤生物學(xué)行為的影響提供了可靠的細(xì)胞模型。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R739.4

【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前6條

1 楊小潔;張磊亮;;脂滴在丙肝病毒生命周期中的作用[J];病毒學(xué)報(bào);2014年01期

2 高學(xué)軍;司雨;張霞;黃玉玲;曲波;李慶章;;SND1對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響[J];東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2014年04期

3 譚玉梅;王玉臣;劉永翔;桑石磊;劉作易;;冠突散囊菌轉(zhuǎn)錄因子stf1基因的克隆及其表達(dá)分析[J];菌物學(xué)報(bào);2015年01期

4 高星杰;張毅;宋娟;付雪;蘇超;張桂敏;張春燕;于林;姚智;楊潔;;SND1蛋白與HuR蛋白相互結(jié)合作用[J];中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào);2014年09期

5 莫蓓莘;符曉婕;莫小為;劉麗;徐曉峰;岳路明;;細(xì)胞質(zhì)處理小體(P-小體)與基因表達(dá)的調(diào)控[J];深圳大學(xué)學(xué)報(bào)(理工版);2015年01期

6 趙麗;肖建平;楊嵐;郭彩琴;;唐氏篩查單項(xiàng)指標(biāo)人絨毛膜促性腺激素水平增高孕婦妊娠結(jié)局分析[J];中國(guó)全科醫(yī)學(xué);2015年27期

相關(guān)會(huì)議論文 前1條

1 郭峻莉;Zhihua Shen;Youling Lan;Yueqiong Kong;Tianfa Li;Wei Jie;;STAT3/Pimlsignaling mediated High glucose-induced proliferation in vascular smooth muscle cells[A];2013海南省第五屆生命科學(xué)聯(lián)合學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2013年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 張桂敏;IL-18和p100蛋白在鼻息肉形成過(guò)程中潛在作用機(jī)制的研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2011年

2 劉珂;Tudor結(jié)構(gòu)域蛋白識(shí)別甲基化精氨酸蛋白的分子機(jī)理研究[D];華中師范大學(xué);2012年

3 徐建威;MiR-497/Pim-1信號(hào)通路對(duì)胰腺癌惡性表型調(diào)控作用及診斷、預(yù)后價(jià)值研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2014年

4 閆春霞;擬南芥Tudor-SN蛋白調(diào)節(jié)植物鹽逆境下生長(zhǎng)機(jī)理分析[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

5 邵潔;人Tudor-SN蛋白參與RNA顆粒形成的機(jī)制探討[D];天津醫(yī)科大學(xué);2011年

6 趙秀娟;Tudor-SN蛋白參與乳腺癌進(jìn)展及脂肪分化的機(jī)制探討[D];天津醫(yī)科大學(xué);2012年

7 周金星;牦牛肺內(nèi)肺動(dòng)脈段結(jié)構(gòu)組織特點(diǎn)及其與黃牛肺動(dòng)脈比較研究[D];甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

8 許朝;EEF1A2在胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及其機(jī)制研究[D];上海交通大學(xué);2014年

9 趙娜;柔嫩艾美耳球蟲(chóng)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶互作蛋白的篩選及功能研究[D];吉林大學(xué);2015年

10 谷春;冠脈不穩(wěn)定斑塊生物標(biāo)志物及其調(diào)節(jié)機(jī)制的研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2015年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 李程;基于功能化氧化石墨烯檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物及抗腫瘤藥靶向傳遞的研究[D];西南大學(xué);2013年

2 張強(qiáng);孕、雄激素受體在腦膜瘤中的表達(dá)及作用[D];大連醫(yī)科大學(xué);2012年

3 李曉霞;Robol在肺癌中的表達(dá)及與肺癌腦轉(zhuǎn)移的關(guān)系[D];天津醫(yī)科大學(xué);2013年

4 佘宇奇;MMP-9在生殖道分泌物和血清中的含量與應(yīng)用研究[D];中南大學(xué);2013年

5 王保亞;人類(lèi)Tudor-SN蛋白表達(dá)抑制MDA-MB-231穩(wěn)定株的建立及鑒定[D];天津醫(yī)科大學(xué);2011年

6 余積飛;納米材料FRET傳感器的構(gòu)建及在腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)中的應(yīng)用[D];西南大學(xué);2012年

7 唐崎;偽狂犬病毒編碼的MICRORNAS功能研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

8 鄭帥;高遷移率蛋白A2（HMGA2）在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其相關(guān)研究[D];山東大學(xué);2014年

9 司雨;SND1基因?qū)δ膛Ｈ橄偕掀ぜ?xì)胞泌乳機(jī)能的影響[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

10 李琳;Rap2信號(hào)通路調(diào)控腎癌細(xì)胞遷移及侵襲的機(jī)制[D];哈爾濱工業(yè)大學(xué);2014年

，

本文編號(hào)：2307111