【摘要】：目的:1.探討扶正抗癌方對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549、PC9、H1650細(xì)胞株侵襲、遷移的影響,并進(jìn)一步在基因和蛋白質(zhì)水平探討其可能的分子機(jī)制;2.探討扶正抗癌方對(duì)非小細(xì)胞肺癌吉非替尼原發(fā)性耐藥細(xì)胞株A549和繼發(fā)性耐藥細(xì)胞株H1650增殖的影響,及其協(xié)同吉非替尼對(duì)細(xì)胞增殖的影響,并進(jìn)一步在基因和蛋白質(zhì)水平上探討其可能的分子機(jī)制;3.建立裸鼠皮下移植瘤模型,進(jìn)一步驗(yàn)證扶正抗癌方及協(xié)同吉非替尼抑制細(xì)胞增殖的分子機(jī)制。方法:1.采用transwell小室和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)扶正抗癌方對(duì)A549、PC9、H1650細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響,采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)扶正抗癌方對(duì)A549、PC9、H1650細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白,如間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志蛋白波形蛋白(Vimentin)和神經(jīng)鈣黏素(N-Cadherin)的影響,檢測(cè)扶正抗癌方對(duì)A549、PC9、H1650細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子 3(signal transducers and actibators of transcription 3,STAT3)的表達(dá),采用蛋白質(zhì)印跡法和MMP-9活力檢測(cè)試劑盒雙重檢測(cè)扶正抗癌方對(duì) A549、PC9、H1650 細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶家族-9(matrixmetalloprotein-9,MMP-9)蛋白質(zhì)和活力的影響,采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方法過(guò)表達(dá)STAT3后,觀察扶正抗癌方在A549、PC9、H1650細(xì)胞中對(duì)MMP-9活力的影響。2.采用MTS法檢測(cè)扶正抗癌方對(duì)吉非替尼原發(fā)和繼發(fā)耐藥細(xì)胞A549、H1650增殖活力的影響及扶正抗癌方聯(lián)合吉非替尼對(duì)A549、H1650增殖活力的影響,采用Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytometry,FCM)檢測(cè)扶正抗癌方對(duì)A549、H1650細(xì)胞凋亡的影響,采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)扶正抗癌方對(duì)A549、H1650細(xì)胞增殖相關(guān)通路Akt(又名蛋白激酶B,PKB)時(shí)間依賴性磷酸化蛋白的影響,濃度依賴性檢測(cè)扶正抗癌方對(duì) A549、H1650 細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子 NF-κB(nuclear factor-κ-gene binding)成員p50和p65蛋白及增殖相關(guān)蛋白黏蛋白1(mucinl,MUC1)的影響,通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)扶正抗癌方對(duì)A549、H1650細(xì)胞MUC1mRNA的表達(dá)水平;采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)扶正抗癌方對(duì)A549、H1650細(xì)胞MUC1啟動(dòng)子活性的影響;采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)分別過(guò)表達(dá)Akt、p65、MUC1后,檢測(cè)扶正抗癌方對(duì)A549、H1650細(xì)胞中其他蛋白及細(xì)胞增殖活力的影響,以此來(lái)確定信號(hào)間的上下游關(guān)系;采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)扶正抗癌方聯(lián)合吉非替尼對(duì)A549、H1650細(xì)胞中Akt、p65、MUC1等蛋白的影響,明確兩者協(xié)同效應(yīng)的作用機(jī)制。3.建立裸鼠皮下移植瘤模型,分別設(shè)立對(duì)照組、扶正抗癌方組、吉非替尼組、扶正抗癌和吉非替尼聯(lián)合給藥組四組,測(cè)量各組腫瘤的體積、重量,稱量裸鼠的體重變化,并通過(guò)小鼠活體成像技術(shù)觀察不同組別的熒光強(qiáng)度等;通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法觀察裸鼠移植瘤組織中p-Akt、p65、MUC1等蛋白的變化。結(jié)果:1.分別給予濃度為0、1、2 mg/mL的扶正抗癌方藥液處理后,與對(duì)照組相比,穿過(guò)transwell小室的細(xì)胞數(shù)量明顯減少(P0.05);用200 μL槍頭對(duì)細(xì)胞行劃痕處理,分別繼續(xù)培養(yǎng)12h和24h后,與對(duì)照組相比,給藥組劃痕寬度更寬(P0.05)。2.給予濃度為1,1.5,2 mg/mL扶正抗癌方藥液處理后,western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,Vimentin、N-Cadherin和MMP-9表達(dá)下調(diào),且隨著給藥濃度的增大,下調(diào)作用逐漸增強(qiáng)(P0.05);MMP-9活力檢測(cè)發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,給藥組MMP-9活力下降,且隨著給藥濃度的增大,抑制作用逐漸增強(qiáng)(P0.05);給予濃度為2 mg/mL的扶正抗癌方藥液處理后,在0.5,2,4,8,24 h時(shí)間點(diǎn)處,與對(duì)照組相比,給藥組p-STAT3(Tyr705)表達(dá)逐漸下調(diào)(P0.05);過(guò)表達(dá)STAT3后加藥組與單獨(dú)加藥組相比,MMP-9活力上調(diào)(P0.05)。3.給予濃度分別為0.5,1,1.5,2,2.5,3 mg/mL的扶正抗癌方藥液處理后,分別于24,48,72 h后測(cè)定各組細(xì)胞活力,與對(duì)照組相比,給藥組在各時(shí)間點(diǎn)處的細(xì)胞活力明顯降低(P0.05);相同時(shí)間點(diǎn)處,隨著給藥濃度的增大,細(xì)胞活力逐漸降低(P0.05);相同給藥濃度,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞活力亦逐漸降低(P0.05);給予濃度分別為0.5,1,1.5 mg/mL的扶正抗癌方藥液處理,24 h后檢測(cè)發(fā)現(xiàn),隨給藥濃度的增加,細(xì)胞早期凋亡和晚期凋亡的比例逐漸增加,而正常細(xì)胞的比例逐漸減少(P0.05)。4.給予濃度為2 mg/mL的扶正抗癌方藥液處理,0.5,2,4,8,24 h后,給藥組p-Akt(Ser473)蛋白的表達(dá)相比對(duì)照組均下調(diào)(P0.05);給予濃度分別為0.5,1,1.5,2,2.5 mg/mL的扶正抗癌方藥液處理,24 h后檢測(cè)發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,給藥組MUC1和p65表達(dá)均下調(diào),且隨給藥濃度的增大,下調(diào)作用逐漸增強(qiáng)(P0.05);給予濃度為2 mg/mL的扶正抗癌方藥液處理后,檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MUC1 mRNA和MUC1 promotor表達(dá)比對(duì)照組下調(diào)(P0.05);過(guò)表達(dá)Akt后加藥組與單獨(dú)加藥組相比,p65表達(dá)上調(diào)(P0.05);過(guò)表達(dá)Akt后加藥組與單獨(dú)加藥組相比,MUC1表達(dá)上調(diào)(P0.05);過(guò)表達(dá)MUC1后加藥組與單獨(dú)加藥組相比,p65表達(dá)基本不變(P0.05);過(guò)表達(dá)MUC1后加藥組與單獨(dú)加藥組相比,p-Akt(Ser473)表達(dá)上調(diào)(P0.05);過(guò)表達(dá)MUC1后加藥組與單獨(dú)加藥組相比,細(xì)胞活力增強(qiáng)(P0.05)。5.扶正抗癌方與吉非替尼聯(lián)合給藥組與吉非替尼單獨(dú)給藥組相比,細(xì)胞活力下降(P0.05),p-Akt(Ser473)蛋白表達(dá)下調(diào)(P0.05),p65 蛋白表達(dá)下調(diào)(P0.05),MUC1蛋白表達(dá)下調(diào)(P0.05)。6.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),吉非替尼單獨(dú)給藥組與對(duì)照組相比,移植瘤的重量、體積和熒光強(qiáng)度差異不明顯(P0.05),扶正抗癌方單獨(dú)給藥組與對(duì)照組相比,移植瘤的重量更輕、體積更小、熒光強(qiáng)度更弱(P0.05),聯(lián)合給藥組與吉非替尼單獨(dú)給藥組相比,移植瘤的重量更輕、體積更小、熒光強(qiáng)度更弱(P0.05);western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),扶正抗癌方單獨(dú)給藥組與對(duì)照組相比,p-Akt(Ser473)、p65和MUC1的表達(dá)均下調(diào)(P0.05),聯(lián)合給藥組與吉非替尼單獨(dú)給藥組相比,p-Akt(Ser473)、p65和MUC1的表達(dá)均下調(diào)(P0.05)。結(jié)論:1.扶正抗癌方以濃度依賴性抑制A549、PC9、H1650細(xì)胞的侵襲和遷移;以濃度依賴性下調(diào)間質(zhì)細(xì)胞代表物Vimentin和N-Cadherin蛋白的表達(dá),逆轉(zhuǎn)上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化,從而抑制非小細(xì)胞肺癌的轉(zhuǎn)移;以濃度依賴性下調(diào)MMP-9蛋白的表達(dá)及MMP-9活力,以時(shí)間依賴性下調(diào)p-STAT3(Tyr705)蛋白的表達(dá),且過(guò)表達(dá)STAT3能逆轉(zhuǎn)扶正抗癌方對(duì)MMP-9活力的下調(diào),表明扶正抗癌方可通過(guò)抑制STAT3-MMP9通路抑制非小細(xì)胞肺癌的轉(zhuǎn)移。2.扶正抗癌方以濃度和時(shí)間依賴性抑制A549細(xì)胞和H1650細(xì)胞的增殖;以濃度依賴性促進(jìn)A549細(xì)胞和H1650細(xì)胞的凋亡;以時(shí)間依賴性下調(diào)p-Akt(Ser473)蛋白的表達(dá),以濃度依賴性下調(diào)MUC1蛋白和p65蛋白的表達(dá),過(guò)表達(dá)Akt可以逆轉(zhuǎn)扶正抗癌方對(duì)p65的抑制,過(guò)表達(dá)p65可以逆轉(zhuǎn)扶正抗癌方對(duì)MUC1蛋白的抑制,而過(guò)表達(dá)MUC1蛋白并不能逆轉(zhuǎn)扶正抗癌方對(duì)p65的抑制,因此考慮p65在MUC1的上游,最后我們過(guò)表達(dá)MUC1逆轉(zhuǎn)扶正抗癌方對(duì)p-Akt(Ser473)的抑制,進(jìn)一步證明我們的假設(shè)是成立的,當(dāng)過(guò)表達(dá)MUC1時(shí),逆轉(zhuǎn)了扶正抗癌方對(duì)增殖的抑制。表明扶正抗癌方通過(guò)Akt-p65-MUC1通路抑制非小細(xì)胞肺癌的增殖。3.扶正抗癌方協(xié)同吉非替尼對(duì)細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)優(yōu)于吉非替尼單藥,其作用機(jī)制亦是通過(guò)抑制Akt-p65-MUC1通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的。4.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了扶正抗癌方以及協(xié)同吉非替尼可通過(guò)Akt-p65-MUC1通路抑制非小細(xì)胞肺癌的增殖。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R734.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2306925