【摘要】：第一部血清脂肪因子水平與多發(fā)性骨髓瘤疾病的關(guān)系 目的：肥胖是腫瘤發(fā)生的一個危險因素,某些脂肪因子血清水平同腫瘤患病風險有-定的聯(lián)系,并同腫瘤的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移及耐藥行為密切相關(guān),本部分通過柃測MM患者血清脂肪因子水平,評估脂肪因子水平在MM中的意義。 方法：采用ELISA檢測28例新診斷的MM患者血清中脂肪因子(瘦素、脂聯(lián)素、抵抗素、內(nèi)脂素)的水平,選取28例性別和年齡匹配的健康的體檢者作為對照組。研究這些脂肪因子水平同MM發(fā)病的關(guān)系；以及同MM疾病分期和MM相關(guān)預(yù)后指標(如骨髓漿細胞%、132微球蛋白和血沉)、常規(guī)生化指標(LDH、ALB、GLB、Ca2-)的相關(guān)性。 結(jié)果：多發(fā)性骨髓瘤患者血清瘦素水平明顯高于對照組(6.82±3.09ng/ml,2.91+1.81ng/ml, p0.01)且較高疾病分期患者(Ⅲ期)血清瘦素水平明顯高于較低疾病分期患者(Ⅰ期和Ⅱ期)；而骨髓瘤患者脂聯(lián)素水平明顯低于對照組(5.79±2.37μ g/ml,9.29±3.45μ g/ml,p0.01),同時較高疾病分期患者(Ⅲ期)血清脂聯(lián)素水平明顯低于較低疾病分期MM患者(Ⅰ期和Ⅱ期)。這提示更低的脂聯(lián)素水平和更高的瘦素水平同患MM風險相關(guān)。在MM患者中,MM患者血清瘦素水平和血清IgG濃度(r=0.607,p=0.001)、骨髓漿細胞比例(r=0.513,p=0.005)、p2微球蛋白(r=0.572,p=0.01),血沉(r=0.374,p=0.05)顯著正相關(guān)；同白蛋白水平(r=-0.546,p=0.003)顯著負相關(guān)；而同LDH(r=-0.014,p=0.943),血紅蛋白濃度(r=-0.279,p=0.151)、血清鈣濃度(r=-0.275,p=0.156)無相關(guān)性。MM患者脂聯(lián)素水平同IgG濃度(r=-0.575,p=0.001)、β2微球蛋白(r=-0.577,p=0.001)、血沉(r=-0.441,p=0.019)顯著負相關(guān)；同白蛋白水平(r=0.517,p=0.005)顯著正相關(guān)。而與骨髓MM細胞比例(r=-0.065,p=0.741)=LDH (r=-0.179,p=0.362)、血紅蛋白1濃度(r=0.262,p=0.179)、血清鈣濃度(r=0.264,p=0.175)無相關(guān)性。內(nèi)脂素和抵抗素同任何一個MM預(yù)后指標無相關(guān)性。 結(jié)論：瘦素在多發(fā)性骨髓瘤患者中水平升高,脂聯(lián)素在骨髓瘤患者中水平降低,因此我們推測脂聯(lián)素在機體中是一個保護因素,而瘦素則增加患上MM的風險。此外血清瘦素水平以及脂聯(lián)素水平同MM臨床指標具有相關(guān)性提示脂肪因子可能對多發(fā)性骨髓瘤預(yù)后評估具有一定的參考意義。 第二部分脂肪細胞通過瘦素/瘦素受體調(diào)節(jié)MM細胞增殖與耐藥 目的：體外實驗探討脂肪細胞及脂肪細胞分泌的脂肪因子瘦素對多發(fā)性骨髓瘤細胞增殖和耐藥的影響及相關(guān)機制。 方法：選取能穩(wěn)定誘導分化的脂肪細胞系3T3-L1,以油紅0的方法對分化的脂肪細胞進行鑒定,用ELISA法檢測其上清分泌的瘦素水平,同時取正常人骨髓,從中分離MSCs,將其分化誘導為脂肪細胞,用ELISA方法檢測其上清瘦素水平。不同的條件處理細胞：MM細胞單獨培養(yǎng)；MM細胞系同3T3-L1脂肪細胞直接接觸共培養(yǎng)；MM細胞系同3T3-L1脂肪細胞直接接觸共培養(yǎng)同時加入瘦素/OB抗體；CFSE的方法檢測MM細胞系增殖情況,PI單標流式細胞學檢測MM細胞系細胞周期；脂肪細胞同MM細胞共培養(yǎng),western blotting檢測脂肪細胞對MM細胞細胞周期調(diào)節(jié)蛋白1cyclinDl及信號通路蛋白AKT及STAT3磷酸化水平的影響。檢測脂肪細胞對MM細胞耐藥的影響。將細胞不同條件處理：MM細胞單獨培養(yǎng)同時加入硼替佐米(或地塞米松)：MM細胞同脂肪細胞直接共培養(yǎng)同時加入硼替佐米(或地塞米松)：采用Annexin V FITC/PI雙染法流式細胞術(shù)檢測脂肪細胞對化療藥物誘導MM細胞凋亡的影響。同時用westernblotting的方法檢測脂肪細胞對MM細胞抗凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和凋亡蛋白caspase-3表達。 結(jié)果：1)3T3-L1細胞系能穩(wěn)定分化為脂肪細胞,分化率在80%-90%左右,將其作為實驗用細胞。2)3T3-L1脂肪細胞和人MSCs分化的脂肪細胞均分泌瘦素。3T3-L1脂肪細胞上清瘦素濃度為：0.88±0.17ng/ml, MSCs分化的脂肪細胞上清瘦素濃度為：1.52±0.12ng/ml3) MM細胞系同3T3-L1直接共培養(yǎng)可促進MM細胞系的增殖,其中細胞系U266和NCI-H929的增殖較對照組具有顯著差異,后續(xù)實驗選取這兩種細胞系進行研究。4)3T3-L1脂肪細胞同MM細胞共培養(yǎng)時,加入抗瘦素/OB抗體后,脂肪細胞促進MM細胞增殖的效應(yīng)被抑制。5)3T3-L1脂肪細胞同MM細胞共培養(yǎng)促進細胞周期,同時上調(diào)細胞周期蛋白cyclinDl的表達。6)共培養(yǎng)使信號通路AKT和STAT3磷酸化水平升高。加入瘦素/OB抗體時, AKT和STAT3的磷酸化水平下降。7)脂肪細胞與MM細胞共培養(yǎng),硼替佐米或地塞米松對MM細胞誘導凋亡的作用被削弱,其中硼替佐米誘導凋亡的作用明顯被削弱8)加入硼替佐米的情況下,3T3-L1脂肪細胞同MM細胞共培養(yǎng)上調(diào)了抗凋亡蛋白Bcl-2,保護MM細胞促凋亡蛋白caspase-3不被活化。 結(jié)論：脂肪細胞通過瘦素/瘦素受體激活A(yù)KT和STAT3信號通路,脂肪細胞同MM細胞共培養(yǎng)上調(diào)細胞周期蛋白cyclinDl和抗凋亡蛋白Bcl-2,保護MM細胞促凋亡蛋白caspase-3不被活化從而促進MM細胞增殖,加強MM細胞耐藥,最終有助于MM細胞生存和發(fā)展。 第三部分瘦素激活JAK/STAT-PI3K/AKT途徑促進MM細胞增殖 目的：研究瘦素促進MM細胞增殖的機制。 方法：應(yīng)用cck8法檢測人重組瘦素對MM細胞U266和NIL-H929的影響。以不同濃度人重組瘦素(25ng/ml-200ng/ml)處理MM細胞,不同時間點(12,24,48小時)檢測MM細胞增殖。檢測瘦素對細胞通路蛋白激活狀態(tài)。50ng/ml瘦素處理MM細胞,在不同時間點收集細胞,Western blotting檢測AKT、STAT3蛋白表達水平及AKT和STAT3磷酸化水平。JAK/STAT化學抑制劑AG490和PI3K化學抑制劑LY294002對瘦素誘導MM細胞增殖的影響及相關(guān)細胞通路蛋白的影響。 結(jié)果：1)人重組瘦素以時間依賴方式促進MM細胞增殖,但不依賴濃度,人重組瘦素在濃度為50ng/ml的濃度下對MM細胞促增殖作用最強,當濃度大于50ng/ml,促增殖作用減弱。2)50ng/ml瘦素升高MM細胞STAT3磷酸化水平,處理后6h磷酸化水平達最高,50ng/ml瘦素升高MM細胞AKT磷酸化水平,處理后1h磷酸化水平達最高。3)LY294002降低了MM細胞AKT磷酸化水平,而對總AKT蛋白水平及STAT3磷酸化水平無影響。AG490處理后,瘦素誘導升高的STAT3磷酸化水平和AKT磷酸化水平均降低,同時加入AG490和瘦素無法升高兩者的磷酸化水平。4)AG490和LY294002均可阻斷瘦素對MM細胞的增殖作用。 結(jié)論：人重組瘦素以時間依賴方式促進MM細胞增殖。瘦素可升高MM細胞STAT3磷酸化水平和AKT磷酸化水平而對總STAT3和AKT無影響。表明瘦素通過激活JAK/STAT-PI3K/AKT途徑促進MM細胞的增殖。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R733.3

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本文編號：2306825