【摘要】：第一章:HATL4在急性髓細(xì)胞性白血病中的表達(dá)及預(yù)后相關(guān)性研究目的:II型跨膜絲氨酸蛋白酶(Type II transmembrane serine proteases,TTSPs)是一類(lèi)通過(guò)氨基末端跨膜區(qū)域錨定在細(xì)胞膜上的絲氨酸蛋白酶。人類(lèi)TTSPs共有17個(gè)成員,在生理及病理過(guò)程中起著廣泛而重要的作用,其功能異常導(dǎo)致癌癥、缺鐵性貧血、高血壓、耳聾等。許多研究證實(shí)TTSPs與實(shí)體腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。我們實(shí)驗(yàn)室對(duì)TTSPs在惡性血液疾病中的作用開(kāi)展了相關(guān)研究。基于前期研究結(jié)果,我們發(fā)現(xiàn)人氣道胰蛋白酶樣蛋白酶4(Human airway trypsin-like protease 4,HATL4)分子在急性髓細(xì)胞性白血病(Acute myeloid leukemia,AML)患者骨髓細(xì)胞中異常表達(dá)。在本研究中,我們以HATL4作為重點(diǎn)研究對(duì)象,深入探討該分子在AML發(fā)生發(fā)展中的作用及潛在機(jī)制,以及成為疾病診斷、預(yù)后指標(biāo)或治療靶點(diǎn)的可行性。為進(jìn)一步研究TTSPs的功能以及它們?cè)谘簮盒阅[瘤中的作用提供依據(jù),也為T(mén)TSPs在腫瘤中的研究拓寬新的角度和視野。研究方法:1.收集惡性血液疾病患者骨髓標(biāo)本,分離骨髓中的白細(xì)胞用于以下各種實(shí)驗(yàn)。2.利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reverse transcription PCR,RT-PCR)和實(shí)時(shí)定量PCR(Quantitative real-time PCR,q RT-PCR)對(duì)人惡性血液病細(xì)胞系和患者骨髓細(xì)胞中HATL4 m RNA的表達(dá)進(jìn)行分析。3.采用蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blotting)檢測(cè)惡性血液病細(xì)胞系和白血病患者骨髓細(xì)胞中HATL4蛋白的表達(dá)。4.使用流式細(xì)胞術(shù)(Flow cytometry,FCM)和免疫熒光染色檢測(cè)正常人外周血(Normal peripheral blood,NPB)白細(xì)胞和AML細(xì)胞系THP-1及AML患者骨髓細(xì)胞中HATL4蛋白的表達(dá)與定位。5.利用q RT-PCR檢測(cè)AML患者治療后骨髓細(xì)胞中HATL4 m RNA的表達(dá)并分析其與臨床參數(shù)的相關(guān)性。研究結(jié)果:1.HATL4 m RNA在AML來(lái)源細(xì)胞系(HEL、SHI-1和THP-1)和慢性粒細(xì)胞性白血病(Chronic myeloid leukemia,CML)來(lái)源細(xì)胞系(KU-812、MEG-01和K562)中表達(dá),而在其它惡性血液病細(xì)胞系中不表達(dá)。另外,HATL4 m RNA在AML患者骨髓細(xì)胞中異常氋表達(dá),而在正常人外周血、骨髓和其他白血病如CML、急性淋巴細(xì)胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia,ALL)、CLL(Chronic lymphocytic leukemia,CLL)患者骨髓細(xì)胞中檢測(cè)不到。2.Western blotting結(jié)果顯示HATL4在AML患者骨髓細(xì)胞中異常表達(dá),而在其它白血病患者骨髓細(xì)胞中未檢測(cè)到HATL4蛋白的表達(dá),與m RNA表達(dá)結(jié)果一致。3.流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)HATL4蛋白表達(dá)于AML患者骨髓細(xì)胞的粒細(xì)胞和單核細(xì)胞表面上,陽(yáng)性率均為100%,不表達(dá)于NPB細(xì)胞及T或B淋巴細(xì)胞表面上。免疫熒光染色證實(shí),HATL4定位于THP-1和AML骨髓細(xì)胞的膜表面。4.在105例治療后AML病人骨髓標(biāo)本中,HATL4 m RNA陽(yáng)性19例,陰性86例�；诿绹�(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)實(shí)踐指南分級(jí),HATL4表達(dá)陽(yáng)性病人為預(yù)后等級(jí)差(47.37%)或中等(52.63%),而在表達(dá)陰性病人中,小部分(4.65%)是預(yù)后等級(jí)差,大部分是預(yù)后等級(jí)中等(69.77%)和良好(25.58%)。在相關(guān)性分析中,骨髓細(xì)胞HATL4 m RNA表達(dá)與患者微小殘留病灶(Minimal residual disease,MRD)和預(yù)后等級(jí)相關(guān),與其他參數(shù)如:年齡、性別、亞型等無(wú)顯著相關(guān)性。Kaplan-Meier法分析顯示,HATL4陽(yáng)性病人無(wú)進(jìn)展生存期顯著短于陰性病人(p=0.0299)。結(jié)論:本章節(jié)研究發(fā)現(xiàn),AML初診患者骨髓細(xì)胞高表達(dá)HATL4 m RNA和蛋白,提示HATL4可能作為診斷AML新的生物標(biāo)志物。此外,AML患者治療后HATL4的表達(dá)與MRD和預(yù)后等級(jí)相關(guān),HATL4表達(dá)水平越高,復(fù)發(fā)的可能性越大,預(yù)后等級(jí)越差。此外,HATL4表達(dá)陽(yáng)性的患者無(wú)進(jìn)展生存期明顯縮短,預(yù)示HATL4陽(yáng)性病人預(yù)后不良。因此,HATL4在AML患者骨髓細(xì)胞中的異常高表達(dá),有望應(yīng)用于AML的臨床早期診斷、靶向治療及預(yù)后評(píng)估。第二章:HATL4的腫瘤細(xì)胞生物學(xué)體外研究研究目的:在第一章中,我們發(fā)現(xiàn)HATL4在AML患者骨髓腫瘤細(xì)胞中異常高表達(dá),并且該表達(dá)與AML病人預(yù)后不良相關(guān)。這些結(jié)果提示,HATL4在腫瘤細(xì)胞的異常表達(dá)可能與AML的病理過(guò)程相關(guān)。我們推測(cè),HATL4的表達(dá)可能影響AML細(xì)胞的腫瘤生物學(xué)功能,從而參與AML的發(fā)生發(fā)展。因此,本研究中我們選用了內(nèi)源性表達(dá)HATL4的急性髓系白血病細(xì)胞系THP-1作為研究對(duì)象,通過(guò)特異性沉默HATL4 m RNA的表達(dá),在體外水平研究HATL4對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響,探討HATL4在AML細(xì)胞生物學(xué)中的作用及可能機(jī)制。研究方法:1.構(gòu)建特異性干擾HATL4的sh RNA(Short hairpin RNA)慢病毒載體,利用磷酸鈣沉淀法制備慢病毒,侵染AML系THP-1細(xì)胞,干擾HATL4 m RNA的表達(dá),用q RT-PCR和Western blotting技術(shù)檢測(cè)慢病毒干擾效率。2.用FCM檢測(cè)對(duì)照組和干擾組中綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)的陽(yáng)性率,以THP-1細(xì)胞為陰性對(duì)照。3.以構(gòu)建的HATL4-pc DNA3.1全長(zhǎng)基因?yàn)槟０?采用定點(diǎn)突變,構(gòu)建HATL4突變體。利用瞬間高壓電穿孔細(xì)胞膜,將HATL4突變體轉(zhuǎn)入到已特異性沉默HATL4的細(xì)胞中,該突變體不能被sh RNA特異性沉默,從而在sh RNA干擾后的THP-1細(xì)胞中恢復(fù)HATL4的表達(dá)。4.通過(guò)流式分選(Flow sorting),用間接熒光染色法將上述電轉(zhuǎn)化表達(dá)HATL4突變體的細(xì)胞分選出來(lái)。5.利用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(Cell counting kit-8,CCK-8)檢測(cè)特異性沉默HATL4m RNA表達(dá)后對(duì)THP-1細(xì)胞增殖能力的影響。6.采用細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)(Transwell migration assay)檢測(cè)HATL4表達(dá)下調(diào)后THP-1細(xì)胞遷移能力的改變。7.通過(guò)基底膜侵襲實(shí)驗(yàn)(Transwell Matrigel invasion assay)檢測(cè)HATL4表達(dá)下調(diào)后THP-1細(xì)胞侵襲能力的改變。另外,在實(shí)驗(yàn)中加入基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase,MMP)抑制劑GM6001,觀察HATL4沉默前后THP-1細(xì)胞侵襲Matrigel能力的改變。8.收集HATL4沉默前后THP-1細(xì)胞的培養(yǎng)上清,通過(guò)明膠酶譜法分析HATL4表達(dá)水平高低對(duì)上清中MMP-2和MMP-9活性的影響。9.轉(zhuǎn)染表達(dá)HATL4于中國(guó)倉(cāng)鼠卵(Chinese hamster ovary,CHO)細(xì)胞膜上,研究HATL4對(duì)重組pro-MMP-2蛋白的活化,用MMP-2活性試劑盒檢測(cè)上清,以此驗(yàn)證HATL4是否參與pro-MMP-2酶原的激活。研究結(jié)果:1.我們采用si RNA特異性沉默HATL4 m RNA的表達(dá)。用含sh H(包含特異性沉默HATL4的sh RNA核苷酸序列,命名為干擾組)和sh NC(以sh H序列為靶序列打亂的核苷酸序列,命名為對(duì)照組)目的質(zhì)粒的病毒侵染THP-1細(xì)胞,培養(yǎng)72 h后,經(jīng)過(guò)FCM檢測(cè)細(xì)胞中GFP的陽(yáng)性率(即病毒侵染效率)大于99%。再經(jīng)q RT-PCR檢測(cè)干擾組的HATL4 m RNA表達(dá)抑制率大約是70%,因此篩選到兩組對(duì)照組(sh NC1和sh NC2)和干擾組(sh H1和sh H2)細(xì)胞。2.將構(gòu)建的兩個(gè)HATL4突變體,電轉(zhuǎn)導(dǎo)入兩個(gè)干擾組細(xì)胞(sh H1和sh H2)中,培養(yǎng)擴(kuò)大后,間接熒光染色,經(jīng)流式分選得到HATL4突變體表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞(命名為恢復(fù)組,sh R1和sh R2)。然后分別用q RT-PCR和Western blotting檢測(cè)HATL4m RNA和蛋白的表達(dá)。與對(duì)照組(sh NC1和sh NC2)相比,干擾組(sh H1和sh H2)細(xì)胞中,HATL4 m RNA和蛋白表達(dá)抑制率約70%。HATL4突變體重新表達(dá)的兩個(gè)恢復(fù)組(sh R1和sh R2)細(xì)胞株中,HATL4 m RNA和蛋白的表達(dá)又恢復(fù)到對(duì)照組水平。結(jié)果表明sh RNA介導(dǎo)的HATL4沉默是特異的,這些細(xì)胞可用于后續(xù)的功能學(xué)研究。3.細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)表明,特異性沉默HATL4表達(dá)以及沉默后又恢復(fù)HATL4表達(dá)對(duì)THP-1細(xì)胞的增殖能力沒(méi)有明顯改變。4.細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)表明,降低HATL4表達(dá)對(duì)THP-1細(xì)胞的遷移能力沒(méi)有明顯改變。5.基底膜侵襲實(shí)驗(yàn)表明,抑制HATL4表達(dá)后,THP-1腫瘤細(xì)胞對(duì)Matrigel的侵襲能力顯著降低。此外,加入MMP抑制劑GM6001明顯降低對(duì)照組和干擾組細(xì)胞侵襲Matrigel的能力,說(shuō)明HATL4增強(qiáng)THP-1細(xì)胞侵襲能力至少在一定程度上是通過(guò)MMPs介導(dǎo)的。6.Western blotting結(jié)果顯示對(duì)照組、干擾組和恢復(fù)組THP-1細(xì)胞上清中pro-MMP-2總量基本相同,但明膠酶譜實(shí)驗(yàn)提示,干擾組細(xì)胞中活化的MMP-2(~62k Da)和MMP-9(~83 k Da)表達(dá)明顯減弱,并且以活化的MMP-2條帶減弱為主。這些結(jié)果提示,HATL4表達(dá)降低可能抑制MMP-2酶原的激活。7.檢測(cè)到HATL4過(guò)表達(dá)的CHO細(xì)胞上清中MMP-2酶原的激活顯著增強(qiáng),提示HATL4可能是通過(guò)激活pro-MMP-2生成MMP-2發(fā)揮其蛋白水解功能,降解基底膜,增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲性。同時(shí)明膠酶譜實(shí)驗(yàn)也證實(shí)有活化的MMP-2生成。結(jié)論:在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,HATL4的表達(dá)不改變AML來(lái)源的THP-1細(xì)胞的增殖和侵襲,但能增強(qiáng)AML來(lái)源的THP-1細(xì)胞侵襲Matrigel以及降解明膠的能力。我們的結(jié)果還提示,HATL4可能是主要通過(guò)激活pro-MMP-2,從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞降解基底膜的侵襲能力。第三章:HATL4在小鼠腫瘤模型中的生物學(xué)研究研究目的:在第一章中,我們發(fā)現(xiàn)蛋白酶HATL4在AML細(xì)胞中異常高表達(dá),而且HATL4的表達(dá)與AML病人治療后預(yù)后不良相關(guān),提示HATL4在AML的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。在第二章中,我們發(fā)現(xiàn)HATL4能夠增強(qiáng)AML來(lái)源的THP-1細(xì)胞侵襲Matrigel的能力。另外,我們通過(guò)明膠酶譜等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HATL4可能是通過(guò)激活MMPs,尤其是MMP-2,從而促進(jìn)細(xì)胞基底膜降解,增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲性。為了進(jìn)一步證實(shí)我們的發(fā)現(xiàn),在本章研究中,我們選用裸小鼠作為研究對(duì)象,將上述對(duì)照組、干擾組和恢復(fù)組細(xì)胞進(jìn)行小鼠皮下荷瘤試驗(yàn),觀察成瘤大小,從體內(nèi)水平來(lái)研究HATL4對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡和血管生成等能力的影響,探討HATL4在AML發(fā)生發(fā)展中的作用及潛在機(jī)制。研究方法:1.將上述對(duì)照組、干擾組和恢復(fù)組THP-1細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)后,皮下接種六周齡雄性裸小鼠后肢內(nèi)側(cè),定期觀察各組成瘤情況,測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)寬,計(jì)算腫瘤體積。2.用免疫組織化學(xué)法對(duì)瘤組織細(xì)胞進(jìn)行Ki-67和CD34染色,分別檢測(cè)瘤組織中細(xì)胞增殖和血管表達(dá)情況。3.通過(guò)脫氧核糖核酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(Td T-mediated d UTP nick end labeling,TUNEL),對(duì)三組裸鼠腫瘤組織切片進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)。研究結(jié)果:1.接種第10天后,可以觀察到裸小鼠后肢內(nèi)側(cè)腫瘤形成。第24天后,干擾組細(xì)胞(sh H1和sh H2)接種的小鼠腫瘤增長(zhǎng)速度顯著低于相應(yīng)的其它兩組。第36天后,小動(dòng)物活體成像觀測(cè)到熒光信號(hào)出現(xiàn)在腫瘤接種部位。在干擾組小鼠,腫瘤熒光信號(hào)較弱,且成瘤體積小,平均腫瘤體積和重量均明顯小于其它兩組。2.與相應(yīng)的對(duì)照組和恢復(fù)組相比,干擾組小鼠腫瘤組織切片中Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少。這一結(jié)果提示抑制HATL4的表達(dá)降低了THP-1細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的增殖能力。因此HATL4在體內(nèi)可能通過(guò)促進(jìn)THP-1細(xì)胞的侵潤(rùn)和增殖能力而發(fā)揮促腫瘤生長(zhǎng)的效應(yīng)。3.在三組裸鼠腫瘤組織切片中,計(jì)數(shù)各500個(gè)細(xì)胞中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示三組陽(yáng)性率沒(méi)有顯著性差異,提示干擾組的THP-1細(xì)胞在裸鼠瘤組織中細(xì)胞凋亡沒(méi)有發(fā)生明顯改變。因此,移植瘤在干擾組裸鼠體Qg生長(zhǎng)速度減緩以及瘤體積的減小并不是由于細(xì)胞凋亡增加而引起的。4.用血管標(biāo)記物CD34對(duì)瘤組織血管進(jìn)行染色并統(tǒng)計(jì),發(fā)現(xiàn)三組的瘤組織血管數(shù)量沒(méi)有明顯差異,提示HATL4的表達(dá)與否并不影響THP-1細(xì)胞移植瘤內(nèi)血管的生成。因此,THP-1細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的成瘤機(jī)制和生長(zhǎng)速度與血管生成沒(méi)有直接關(guān)系。結(jié)論:在裸鼠體內(nèi)腫瘤模型中,HATL4可以促進(jìn)THP-1來(lái)源的腫瘤細(xì)胞增殖,加快腫瘤生長(zhǎng)速度。這一結(jié)果提示,HATL4可能參與AML的病理過(guò)程,促進(jìn)AML的發(fā)生發(fā)展�？傊�,我們首次發(fā)現(xiàn)II型跨膜絲氨酸蛋白酶HATL4在AML初診病人中異常高表達(dá),提示HATL4可以成為一個(gè)診斷AML新的生物標(biāo)志物。我們的結(jié)果也顯示AML患者治療后骨髓細(xì)胞中HATL4的表達(dá)與MRD和預(yù)后等級(jí)呈顯著相關(guān)。因此,HATL4在AML骨髓細(xì)胞中的異常高表達(dá),有望應(yīng)用于AML的臨床早期診斷、靶向治療及預(yù)后評(píng)估。在HATL4的作用機(jī)制方面,我們發(fā)現(xiàn)HATL4能激活MMPs,特別是MMP-2,通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì),促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和生長(zhǎng)而參與AML發(fā)生發(fā)展的病理過(guò)程。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R733.71
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本文編號(hào)：2304674