【摘要】：理想的腫瘤治療方案旨在選擇性的殺傷腫瘤細(xì)胞。腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TNF related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)是TNF超家族一員,具有廣譜的抗腫瘤功能,且其對于正常組織和細(xì)胞幾乎無毒,因此近年來作為一種新型靶向抗腫瘤分子得到了廣泛的研究和應(yīng)用。臨床研究顯示,重組可溶性TRAIL蛋白毒副作用低、無免疫原性,在腫瘤的靶向治療方面具有良好應(yīng)用前景。然而研究表明,重組TRAIL的活性依賴其同源三聚體狀態(tài),且僅通過三聚體中心的Zn2+與各個單體上的半胱氨酸通過螯合作用維持。重組可溶性TRAIL本身半衰期較短、穩(wěn)定性差、生物活性不強,并且有研究表明引入標(biāo)簽后會影響三聚體結(jié)構(gòu)秩序從而產(chǎn)生肝毒性。這些缺點制約了其進(jìn)一步的臨床應(yīng)用。因此,設(shè)計一種穩(wěn)定的,低毒性的TRAIL衍生物或TRAIL融合蛋白有望較好地解決重組TRAIL目前存在的問題,有利于其臨床研究和應(yīng)用。Fiber蛋白是腺病毒表面的同源三聚體形式的纖毛蛋白,由基底蛋白tail,螺旋結(jié)構(gòu)的shaft和結(jié)頭蛋白knob組成。前期的研究表明,在shaft臨近C端的2個或2個以上螺旋結(jié)構(gòu)可以促進(jìn)knob三聚體的形成。另外有報道稱,帶有tail結(jié)構(gòu)的截短型shaft能夠作為三聚體基序促進(jìn)其它三聚形式的蛋白折疊。而通過結(jié)構(gòu)分析我們發(fā)現(xiàn),TRAIL三聚體與knob三聚體的三維結(jié)構(gòu)十分相似�；谶@些序列和結(jié)構(gòu)的理論基礎(chǔ),我們選擇利用腺病毒的fiber三聚體與可溶性TRAIL融合表達(dá),設(shè)計并在原核體系表達(dá)了三種全新的重組可溶性TRAIL(soluble TRAIL,s TR)融合蛋白:禽類1型腺病毒的fiber:fowl Ad1 fiber s TR(FA1FT),人5型腺病毒的fiber:human Ad5 fiber s TR(HA5FT)和human Ad5 shaft s TR(HA5ST)。希望利用外源的三聚體來維持TRAIL活性三聚體構(gòu)象,不完全依賴于Zn2+螯合作用,同時選擇截短型的shaft,避免造成shaft引起的肝靶向作用。在獲得純化后的s TR蛋白后,切去多聚組氨酸,以排除標(biāo)簽帶來的肝毒性,然后在s TR樣品中加入Zn Cl2維持其三聚體結(jié)構(gòu)狀態(tài),另外在各組蛋白樣品中均加入DTT以避免高聚物的形成。最后用HPLC測定s TR、FA1FT、HA5FT和HA5ST蛋白的三聚體純度。在體外檢測中,我們選取本實驗室存有的多種腫瘤細(xì)胞系(包括人乳腺癌細(xì)胞、人肝癌細(xì)胞、人宮頸癌細(xì)胞和人肺癌細(xì)胞等)檢測重組TRAIL蛋白的體外殺傷活性,以及對正常組織細(xì)胞系的毒性作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)s TR、FA1FT和HA5ST都能夠不同程度的殺傷腫瘤細(xì)胞,而HA5FT的殺傷作用并不顯著,推測原因可能是融合HA5F結(jié)構(gòu)域?qū)RAIL三聚體產(chǎn)生了空間位阻,使TRAIL的三聚體構(gòu)象發(fā)生變化,不能夠與其死亡受體有效結(jié)合,在本論文后續(xù)的實驗中不再使用。通過caspase活力檢測、流式細(xì)胞術(shù)和DAPI染色方法確定重組蛋白對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用是通過凋亡途徑實現(xiàn)的。然后將s TR、FA1FT和HA5ST在4℃和37℃的PBS或37℃血漿的體系中放置不同時間,評價各組蛋白體外穩(wěn)定性。結(jié)果顯示,融合表達(dá)的FA1FT和HA5ST對腫瘤細(xì)胞的殺傷能力及其穩(wěn)定性與s TR相比都有顯著的提升,并且我們認(rèn)為,蛋白活性的增強歸因于穩(wěn)定性的提升。在體內(nèi)研究實驗中,我們建立了乳腺癌荷瘤裸鼠模型,通過注射不同劑量和不同途徑比較s TR、FA1FT和HA5ST的體內(nèi)抗腫瘤活性。進(jìn)而分析藥代動力學(xué)及蛋白的組織分布來評價體內(nèi)代謝穩(wěn)定性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)HA5ST在體內(nèi)的半衰期在6小時以上,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于天然狀態(tài)的s TR(30min),這種代謝穩(wěn)定性的提升使得HA5ST的抗腫瘤能力大大提高,即使在低劑量的治療中,也有6/10裸鼠的腫瘤被完全清除。出乎我們意料的是,靜脈注射及腹腔注射FA1FT的抗腫瘤能力并不理想,而在原位治療中FA1FT表現(xiàn)出較好的抑瘤效果。藥代動力學(xué)及體內(nèi)分布實驗發(fā)現(xiàn),FA1FT在肝臟大量聚集,導(dǎo)致其不能夠有效的靶向腫瘤組織,這可能是因為融合的三聚體基序包含了全部的shaft結(jié)構(gòu)。體內(nèi)毒性檢測結(jié)果表明,s TR、FA1FT和HA5ST都不會造成肝腎損傷。通過本論文的研究得出如下,選擇腺病毒shaft C端的1-2個螺旋結(jié)構(gòu)與TRAIL融合表達(dá)是科學(xué)合理的,既可以安全有效地提高三聚體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和抗腫瘤活性,又不會造成肝、腎損傷。本論文的研究為重組TRAIL的應(yīng)用提供了新的思路,也為后續(xù)的臨床前研究奠定良好的基礎(chǔ)。
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【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R730.5

【參考文獻(xiàn)】

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1 Fiona C. KIMBERLEY,Gavin R. SCREATON;Following a TRAIL: Update on a ligand and its five receptors[J];Cell Research;2004年05期

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本文編號：2303794