【摘要】：第一部分HSP90β穩(wěn)定FAK調控乳腺癌細胞侵襲轉移研究目的：HSP90是一種高度保守的分子伴侶,它通過參與顧客蛋白的折疊、成熟與降解過程而調節(jié)相關信號轉導途徑；作為一種重要的酪氨酸激酶,FAK尚未被認為是HSP90的顧客蛋白。本課題通過檢測HSP90p與FAK之間是否存在相互作用,以及它們之間相互作用的機制,尋找與腫瘤發(fā)生相關的HSP90新的客戶蛋白,探討FAK在MDA-MB-231乳腺癌細胞中調節(jié)細胞生長、遷移和侵襲的機理,從而提供與HSP90抑制劑相組合的潛在藥物,以及為研發(fā)靶向蛋白質-蛋白質相互作用的抗癌藥物提供理論依據(jù)。研究方法：1.通過構建質粒,采用免疫共沉淀、GST Pull-down、免疫熒光等方法研究HSP90β和FAK的相互作用；2.利用HSP90抑制劑17-AAG處理乳腺癌細胞,利用CHX阻斷細胞內蛋白質的合成,觀察HSP90β對FAK穩(wěn)定性的影響；以17-AAG和MG-132單獨或共同處理MDA-MB-231細胞,用FAK抗體進行免疫共沉淀泛素蛋白,檢測FAK是否經(jīng)過泛素／蛋白酶體途徑被降解；3.通過建立穩(wěn)定細胞系、Soft-agar實驗、細胞劃痕實驗、Transwell實驗和細胞骨架染色實驗,檢測HSP90β和FAK被抑制后對乳腺癌MDA-MB-231細胞的生長和侵襲轉移的影響。研究結果：1.成功構建HSP90β全長以及三個結構域突變體(蛋白N端1-232片斷、中端233-620片斷、C端621-724片斷)的表達質粒。2.免疫共沉淀證實內源性和外源性的HSP90β與FAK之間存在相互作用,免疫熒光實驗表明在MDA-MB-231和H4細胞中,HSP90β與FAK存在明顯的共定位。3.HSP90 β的第233-620位氨基酸區(qū)間是與FAK相互作用的主要結合位點。4.FAK通過蛋白酶體途徑被降解,HSP90β能穩(wěn)定FAK蛋白避免其降解。5.FAK的抑制劑PF-573228和HSP90的抑制劑17-AAG能明顯抑制MDA-MB-231細胞生長、遷移和侵襲；利用RNA干涉技術特異性抑制FAK或HSP90β的表達減少MDA-MB-231細胞的生長和遷移。6.PF-573228和17-AAG干擾MDA-MB-231和H4細胞的細胞骨架而影響細胞遷移。研究結論：1.HSP90β與FAK存在相互作用,HSP90β的中間結構域是與FAK蛋白結合的主要結構域。2.HSP90β能穩(wěn)定FAK蛋白。沒有HSP90的保護,FAK將經(jīng)過蛋白酶體依賴的途徑被降解,表明FAK應該是HSP90的一個新客戶蛋白。3.HSP90β可以調控FAK信號途徑,并在促進乳腺癌細胞的生長和轉移過程中起著重要的作用。4.FAK或HSP90β抑制劑對乳腺癌細胞表現(xiàn)出降低細胞生長和轉移的相似作用,為腫瘤的治療提供了一種新的途徑。第二部分Enterolactone對乳腺癌細胞生長和轉移的抑制作用研究目的：富含木酚素的食物已被證實能降低患乳腺癌的風險。已報道木酚素的活性代謝物腸內酯(Enterolactone, ENL)有抗雌激素受體(ER)陰性乳腺癌的作用,但ENL影響乳腺癌細胞生長和轉移的機制還不太清楚,本實驗的目的是研究ENL抗腫瘤的分子機制。研究方法：1.MTT法檢測ENL對MDA-MB-231細胞增殖的影響,流式細胞儀檢測ENL對細胞周期的影響,Q-PCR檢測ENL對細胞增殖和細胞周期相關基因表達的影響,Western blot檢測FAK磷酸化。2.通過細胞劃痕實驗、Transwell實驗和細胞骨架染色實驗,觀察ENL對MDA-MB-231細胞遷移、侵襲和細胞骨架的影響。研究結果：1.ENL能抑制MDA-MB-231生長,并呈現(xiàn)藥物濃度和時間梯度依賴性,ENL作用于MDA-MB-231細胞48h的IC50值為261.9±10.5gM。2.ENL誘導細胞周期S期的細胞比例增大。ENL (50 μM、100 μM和200μM)處理48小時后,S期細胞的比例由7.03%分別增加到19.35%、21.67%和28.32%,同時G1和G2/M期細胞的比例減少。3.ENL下調細胞增殖基因Ki67、PCNA和FoxMl的表達。同時細胞周期S、G2/M期相關基因Cyclin E1、Cyclin A2、Cyclin B1和Cyclin B2的表達被抑制,但參與G0/G1期調節(jié)的基因CDK4、CDK6和Cyclin D1的表達水平?jīng)]有明顯改變。4.ENL降低FAK及其下游效應蛋白樁蛋白的磷酸化水平。5.ENL干擾細胞骨架,抑制MDA-MB-231細胞遷移和侵襲。研究結論：1.ENL通過抑制細胞增殖基因Ki-67、PCNA和FoxM1的表達影響細胞生長,通過下調細胞周期S、G2/M期相關基因的表達影響細胞周期。2.ENL通過阻斷FAK/paxillin信號通路,干擾乳腺癌細胞的細胞骨架而影響細胞遷移能力,提示腸內酯為乳腺癌潛在的抗癌劑。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R737.9

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本文編號：2302635