【摘要】：第一部分HSP90β穩(wěn)定FAK調(diào)控乳腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移研究目的：HSP90是一種高度保守的分子伴侶,它通過參與顧客蛋白的折疊、成熟與降解過程而調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑；作為一種重要的酪氨酸激酶,FAK尚未被認(rèn)為是HSP90的顧客蛋白。本課題通過檢測(cè)HSP90p與FAK之間是否存在相互作用,以及它們之間相互作用的機(jī)制,尋找與腫瘤發(fā)生相關(guān)的HSP90新的客戶蛋白,探討FAK在MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞中調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和侵襲的機(jī)理,從而提供與HSP90抑制劑相組合的潛在藥物,以及為研發(fā)靶向蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的抗癌藥物提供理論依據(jù)。研究方法：1.通過構(gòu)建質(zhì)粒,采用免疫共沉淀、GST Pull-down、免疫熒光等方法研究HSP90β和FAK的相互作用；2.利用HSP90抑制劑17-AAG處理乳腺癌細(xì)胞,利用CHX阻斷細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成,觀察HSP90β對(duì)FAK穩(wěn)定性的影響；以17-AAG和MG-132單獨(dú)或共同處理MDA-MB-231細(xì)胞,用FAK抗體進(jìn)行免疫共沉淀泛素蛋白,檢測(cè)FAK是否經(jīng)過泛素／蛋白酶體途徑被降解；3.通過建立穩(wěn)定細(xì)胞系、Soft-agar實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞骨架染色實(shí)驗(yàn),檢測(cè)HSP90β和FAK被抑制后對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲轉(zhuǎn)移的影響。研究結(jié)果：1.成功構(gòu)建HSP90β全長(zhǎng)以及三個(gè)結(jié)構(gòu)域突變體(蛋白N端1-232片斷、中端233-620片斷、C端621-724片斷)的表達(dá)質(zhì)粒。2.免疫共沉淀證實(shí)內(nèi)源性和外源性的HSP90β與FAK之間存在相互作用,免疫熒光實(shí)驗(yàn)表明在MDA-MB-231和H4細(xì)胞中,HSP90β與FAK存在明顯的共定位。3.HSP90 β的第233-620位氨基酸區(qū)間是與FAK相互作用的主要結(jié)合位點(diǎn)。4.FAK通過蛋白酶體途徑被降解,HSP90β能穩(wěn)定FAK蛋白避免其降解。5.FAK的抑制劑PF-573228和HSP90的抑制劑17-AAG能明顯抑制MDA-MB-231細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和侵襲；利用RNA干涉技術(shù)特異性抑制FAK或HSP90β的表達(dá)減少M(fèi)DA-MB-231細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移。6.PF-573228和17-AAG干擾MDA-MB-231和H4細(xì)胞的細(xì)胞骨架而影響細(xì)胞遷移。研究結(jié)論：1.HSP90β與FAK存在相互作用,HSP90β的中間結(jié)構(gòu)域是與FAK蛋白結(jié)合的主要結(jié)構(gòu)域。2.HSP90β能穩(wěn)定FAK蛋白。沒有HSP90的保護(hù),FAK將經(jīng)過蛋白酶體依賴的途徑被降解,表明FAK應(yīng)該是HSP90的一個(gè)新客戶蛋白。3.HSP90β可以調(diào)控FAK信號(hào)途徑,并在促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移過程中起著重要的作用。4.FAK或HSP90β抑制劑對(duì)乳腺癌細(xì)胞表現(xiàn)出降低細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的相似作用,為腫瘤的治療提供了一種新的途徑。第二部分Enterolactone對(duì)乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的抑制作用研究目的：富含木酚素的食物已被證實(shí)能降低患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)。已報(bào)道木酚素的活性代謝物腸內(nèi)酯(Enterolactone, ENL)有抗雌激素受體(ER)陰性乳腺癌的作用,但ENL影響乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的機(jī)制還不太清楚,本實(shí)驗(yàn)的目的是研究ENL抗腫瘤的分子機(jī)制。研究方法：1.MTT法檢測(cè)ENL對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響,流式細(xì)胞儀檢測(cè)ENL對(duì)細(xì)胞周期的影響,Q-PCR檢測(cè)ENL對(duì)細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá)的影響,Western blot檢測(cè)FAK磷酸化。2.通過細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞骨架染色實(shí)驗(yàn),觀察ENL對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞遷移、侵襲和細(xì)胞骨架的影響。研究結(jié)果：1.ENL能抑制MDA-MB-231生長(zhǎng),并呈現(xiàn)藥物濃度和時(shí)間梯度依賴性,ENL作用于MDA-MB-231細(xì)胞48h的IC50值為261.9±10.5gM。2.ENL誘導(dǎo)細(xì)胞周期S期的細(xì)胞比例增大。ENL (50 μM、100 μM和200μM)處理48小時(shí)后,S期細(xì)胞的比例由7.03%分別增加到19.35%、21.67%和28.32%,同時(shí)G1和G2/M期細(xì)胞的比例減少。3.ENL下調(diào)細(xì)胞增殖基因Ki67、PCNA和FoxMl的表達(dá)。同時(shí)細(xì)胞周期S、G2/M期相關(guān)基因Cyclin E1、Cyclin A2、Cyclin B1和Cyclin B2的表達(dá)被抑制,但參與G0/G1期調(diào)節(jié)的基因CDK4、CDK6和Cyclin D1的表達(dá)水平?jīng)]有明顯改變。4.ENL降低FAK及其下游效應(yīng)蛋白樁蛋白的磷酸化水平。5.ENL干擾細(xì)胞骨架,抑制MDA-MB-231細(xì)胞遷移和侵襲。研究結(jié)論：1.ENL通過抑制細(xì)胞增殖基因Ki-67、PCNA和FoxM1的表達(dá)影響細(xì)胞生長(zhǎng),通過下調(diào)細(xì)胞周期S、G2/M期相關(guān)基因的表達(dá)影響細(xì)胞周期。2.ENL通過阻斷FAK/paxillin信號(hào)通路,干擾乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞骨架而影響細(xì)胞遷移能力,提示腸內(nèi)酯為乳腺癌潛在的抗癌劑。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R737.9

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本文編號(hào)：2302635