【摘要】：急性胰腺炎發(fā)病率近年來呈不斷上升的趨勢,新修訂的亞特蘭大標準將急性胰腺炎分為間質(zhì)水腫性胰腺炎和壞死性胰腺炎。壞死性胰腺炎是指胰腺實質(zhì)或胰腺周圍組織的壞死,單純胰腺組織壞死約占5%,單純胰腺周圍組織壞死約占20%,大部分患者同時合并胰腺及胰腺周圍組織壞死。三種類型的壞死性胰腺炎均可為無菌性炎癥,也可伴發(fā)感染。壞死性胰腺炎約占急性胰腺炎的10-20%,胰腺壞死與感染、器官功能障礙等諸多并發(fā)癥相關(guān),導致并發(fā)癥發(fā)生率及死亡率明顯增加,因此患者總體預后差。急性胰腺炎的自然病程主要分為以炎癥反應為主要特征的第一階段以及以感染和膿毒血癥為主要特點的第二階段。壞死并發(fā)感染會使患者死亡率明顯升高。因此,在急性胰腺炎第一階段通過實驗室檢查或臨床指標早期評估患者預后,對高風險的患者采取積極的治療措施,減少胰腺腺泡細胞壞死,對于改善患者的預后具有重要意義。MicroRNAs (miRNA)是一種單鏈非編碼RNA,長度約為18-25nt,可通過與目的基因3'-UTR區(qū)結(jié)合抑制基因翻譯或促進其降解,從而降低目的蛋白表達水平。miRNA雖然只占人類基因組的1%,但可調(diào)控約60%的蛋白表達基因。目前研究表明miRNA可參與細胞多種重要的生命活動過程,包括增殖、分化及凋亡等;此外,miRNA在炎癥、腫瘤等疾病中也發(fā)揮重要作用。但目前尚無miRNA在壞死性胰腺炎中的作用報道。本研究通過構(gòu)建體內(nèi)壞死性胰腺炎模型,經(jīng)miRNA芯片篩選與胰腺腺泡細胞壞死明顯相關(guān)的miRNA,進一步驗證該miRNA在腺泡細胞壞死中的具體作用,并對其機制進行初步探索。為將miRNA應用于壞死性胰腺炎的診斷及治療提供初步證據(jù)。[目的]篩選與壞死性胰腺炎相關(guān)的miRNA,并驗證其在胰腺腺泡細胞壞死中的作用及機制,為將miRNA應用于壞死性胰腺炎的診斷及治療提供依據(jù)。[方法]1. 通過L-精氨酸腹腔注射構(gòu)建壞死性胰腺炎SD大鼠模型,經(jīng)HE染色檢測模型是否構(gòu)建成功;經(jīng)miRNA芯片篩選與壞死性胰腺炎相關(guān)的miRNA。2.通過�；鞘懰�-3-硫酸醋二鈉鹽(Taurolithocholic Acid 3-sulfate Disodium Salt,TLC-S)處理胰腺腺泡細胞構(gòu)建壞死性胰腺炎細胞模型,檢測淀粉酶含量驗證模型是否構(gòu)建成功。3 .在體外模型組及體外對照組AR42J細胞中轉(zhuǎn)染mimic miR-19b、miR-19b antisense oligonucleotide (miR-19b ASO)及陰性對照(negative control, NC),qRT-PCR驗證miR-19b表達量改變;檢測轉(zhuǎn)染后各組AR42J細胞壞死率。4. qRT-PCR檢測間質(zhì)水腫性胰腺炎患者、壞死性胰腺炎患者及健康查體者臨床血液標本中miR-19b含量,驗證其與壞死性胰腺炎的關(guān)系。5. qRT-PCR檢沏測轉(zhuǎn)染 mimic miR-19b、miR-19b ASO 及 NC 的 AR42J 細胞中 IL-1β、IL-6 及 TNFα 的 mRNA 變化。[結(jié)果]1. HE染色檢測發(fā)現(xiàn)L-精氨酸處理組大鼠有大量腺泡細胞壞死,說明壞死性胰腺炎SD大鼠模型構(gòu)建成功,命名為體內(nèi)模型組,對照組命名為體內(nèi)對照組;經(jīng)miRNA芯片篩選發(fā)現(xiàn)miR-19b表達量 與壞死性胰腺炎明顯相關(guān)。2.淀粉酶含量檢測發(fā)現(xiàn)TLC-S處理組AR42J細胞培養(yǎng)基上清中淀粉酶含量明顯升高,證明壞死性胰腺炎細胞模型構(gòu)建成功。構(gòu)建成功的壞死性胰腺炎細胞模型命名為體外模型組, 對照組命名為體外對照組。3.經(jīng)qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)mimic miR-19b組miR-19b表達量較NC組明顯升高,miR-19bASO組miR-19b表達量較NC組明顯降低。在體外模型組細胞中mimic miR-19b組細胞壞死率較NC組明顯升高,miR-19b ASO組細胞壞死率較NC組明顯降低。4. qRT-PCR檢測臨床血液標本中miR-19b含量發(fā)現(xiàn)間質(zhì)水腫性胰腺炎患者miR-19b含量較健康對照組明顯升高;壞死性胰腺炎患者miR-19b含量明顯高于間質(zhì)水腫性胰腺炎患者及健康對照組。 5.經(jīng) qRT-PCR 檢測轉(zhuǎn)染 mimic miR-19b、miR-19b ASO 及 NC 的 AR42J 細胞中IL-1β、IL-6及TNFαmRNA變化。結(jié)果顯示相對于NC組細胞,mimicmiR-19b組 IL-1β、IL-6 及 TNFαmRNA 含量均明顯升高,而 miR-19bASO 組 IL-1β、IL-6及TNFα mRNA含量均明顯均明顯降低[結(jié)論]1. miR-19b可促進壞死性胰腺炎患者腺泡細胞壞死的發(fā)生。2. miR-19b可通過調(diào)節(jié)IL-1β、IL-6及TNFαmRNA水平介導壞死性胰腺炎炎癥反應,進而促進胰腺腺泡細胞壞死。胰腺導管腺癌(Pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)是臨床上腫瘤致死的主要原因之一,其起病隱匿、轉(zhuǎn)移出現(xiàn)早,約80%的患者在就診時已失去手術(shù)機會,手術(shù)患者術(shù)后復發(fā)率高、預后差,患者總體5年生存率低于6%,行手術(shù)切除并聯(lián)合輔助治療的患者中位生存時間僅24個月,明顯低于其他實體腫瘤患者中位生存時間。目前手術(shù)切除的PDAC患者主要的輔助治療方案是以吉西他濱為主的化療;近年研究報道對于出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的PDAC患者采用聯(lián)合化療方案可延長患者生存時間,聯(lián)合化療反應率為23-31%,患者無病生存時間為5.5-6.6個月,總體生存時間為8.5-11個月。由此可見,聯(lián)合化療PDAC患者預后仍很差,且聯(lián)合化療使不良反應率顯著增加,明顯降低患者生活質(zhì)量。早期診斷和早期切除是目前延長患者生存時間最為有效的方法;PDAC預后不良與腫瘤異質(zhì)性高、對化療不敏感有直接關(guān)系,因此通過進一步研究PDAC發(fā)生發(fā)展機制,尋找早期診斷標志物及更為有效的治療靶點對改善患者預后具有重要意義。MicroRNAs (miRNA)是非編碼的小RNA,可直接作用于靶向mRNAs抑制其翻譯或增加其降解從而降低表達水平。miRNA可作為調(diào)控細胞增殖、分化及凋亡的關(guān)鍵節(jié)點,在腫瘤細胞中異常表達可成為重要的促癌或抑癌因子,影響腫瘤對化療反應率。miRNA靶向藥物被視為腫瘤治療重要措施。miR-19b是miR-17-92集簇的重要促癌因子,研究表明其在乳腺癌、肺癌及胃癌等多種腫瘤中可通過直接作用于TP53、PTEN等重要抑癌基因發(fā)揮促癌功能,并可作為判斷患者預后的指標;miRNA結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,可通過血液標本檢測,其在腫瘤早期診斷中的價值也受到越來越多的重視。但miR-19b在PDAC中的作用尚未明確。本研究主要探索miR-19b在PDAC細胞增殖、轉(zhuǎn)移的作用及機制,以進一步明確PDAC發(fā)生發(fā)展的機制,同時為其早期診斷及治療提供新的思路。第一節(jié)miR-19b在PDAC增殖及轉(zhuǎn)移中的作用研究[目的]檢測miR-19b在PDAC細胞系及病人血液標本中的表達量,并研究miR-19b在PDAC細胞增殖、遷移及侵襲中的作用。[方法]1.通過qRT-PCR檢測人胰腺導管正常上皮細胞HPDE、人PDAC細胞系PANC1、MiaPaCa2、BxPC3及人PDAC轉(zhuǎn)移細胞系COL0357、FG中miR-19b的表達水平,初步探索miR-19b在PDAC中的功能。2.收集山東大學齊魯醫(yī)院和河南省人民醫(yī)院63例PDAC患者及50例健康查體者血液標本,通過qRT-PCR檢測健康對照組及PDAC患者血液標本中miR-19b表達水平,進一步驗證miR-19b在PDAC中的功能。 3.構(gòu)建miR-19b穩(wěn)定高表達及低表達細胞系。通過Transwell小室細胞遷移實驗和Matrigel細胞侵襲實驗驗證miR-19b沉默和高表達的PDAC細胞遷移和侵襲能力改變,明確miR-19b對PDAC細胞遷移和侵襲能力的影 響。4.通過MTT實驗和克隆形成實驗檢測miR-19b沉默及高表達后PDAC細胞增殖能力的變化,并通過Western blotting進一步檢測PDAC細胞增殖標志物p21及p27在miR-19b沉默及高表達后表達量改變,明確miR-19b對PDAC細胞增殖能力的影響。[結(jié)果]1. qRT-PCR檢測結(jié)果顯示人胰腺導管正常上皮細胞HPDE中miR-19b表達量明顯低于人PDAC細胞系PANC1、MiaPaCa2、BxPC3及轉(zhuǎn)移細胞系COL0357、FG中miR-19b的表達水平,說明miR-19b在PDAC中可能具有促 癌作用。2.通過qRT-PCR檢測63例PDAC患者及50例健康查體者血液標本中miR-19b表達水平發(fā)現(xiàn)PDAC患者血液中miR-19b表達水平明顯高于健康對照組,進一步說明miR-19b在PDAC中 具有促癌作用。3.通過Transwell小室細胞遷移實驗和Matrigel細胞侵襲實驗驗證miR-19b沉默的PDAC細胞遷移和侵襲能力明顯下降,miR-19b高表達的PDAC細胞遷移和侵襲能力顯著增強,說明miR-19b可增強PDAC細胞遷移和侵襲能力。4.通過MTT實驗和克隆形成實驗檢測發(fā)現(xiàn)miR-19b沉默能夠明顯降低PDAC細胞增殖能力,miR-19b高表達可明顯增強PDAC細胞增殖能力;Western blotting結(jié)果顯示miR-19b沉默后PDAC細胞增殖標志物p21及p27表達量明顯升高,miR-19b高表達后p21及p27表達量顯著降低。上述結(jié)果證實miR-19b可增強PDAC細胞增殖能力。[結(jié)論]1.miR-19b可促進PDAC細胞遷移和侵襲;2.miR-19b可增強PDAC細胞增殖能力。第二節(jié)miR-19b促進PDAC細胞轉(zhuǎn)移能力的機制研究[目的]腫瘤轉(zhuǎn)移是造成PDAC患者死亡最為主要的原因,上述研究中我們已經(jīng)證實miR-19b可促進PDAC細胞侵襲和遷移,本部分研究中我們將進一步探索miR-19b增強PDAC細胞侵襲和遷移能力的具體機制。[方法]1.經(jīng)Western blotting檢測miR-19b沉默和高表達后PDAC細胞腫瘤干細胞特性標志物(CD133、c-Met、FOXM1)的表達改變,并經(jīng)sphere formation實驗檢測miR-19b沉默和高表達后PDAC腫瘤干細胞自我更新能力的變化,探索miR-19b是否通過影響PDAC細胞腫瘤干細胞特性促進細胞 遷移和侵襲。2.經(jīng)microRNA.org和TargetScan預測miR-19b的靶向mRNA,結(jié)合前期研究報道中PDAC腫瘤干細胞特性調(diào)控常見分子和信號通路,篩選miR-19b影響PDAC細胞腫瘤干細胞特性的可能分子;經(jīng)Western blotting檢測miR-19b高表達后所預測分子蛋白表達水平改變,選擇蛋白表達水平降低的分子進一 步驗證其功能。3.在miR-19b高表達的PDAC細胞中轉(zhuǎn)染所選擇的靶基因cDNA以增強其表達水平,通過Western blotting檢測該基因高表達是否能夠逆轉(zhuǎn)miR-19b高表達后PDAC細胞腫瘤干細胞特性標志物(CD133、c-Met、FOXM1)的表達增強,并經(jīng)sphere formation實驗檢測該基因高表達是否能夠逆轉(zhuǎn)miR-19b高表達后PDAC腫瘤干細胞自我更新能力的增強。4.經(jīng)Tanswell小室細胞遷移實驗和Matrigel細胞侵襲實驗證實所選擇的基因高表達能否逆轉(zhuǎn)miR-19b高表達引起的細胞遷移和侵襲能力增強。[結(jié)果]1.經(jīng)Western blotting檢測證實miR-19b沉默后PDAC腫瘤干細胞特性標志物(CD133、c-Met、FOXM1)的表達明顯降低,miR-19b高表達后PDAC細胞腫瘤干細胞特性標志物(CD133、c-Met、FOXM1)的表達明顯增強;經(jīng)sphere formation實驗檢測可見miR-19b沉默后PDAC腫瘤干細胞自我更新能力明顯降低,可見miR-19b高表達后PDAC腫瘤干細胞自我更新能力明顯增強。說明miR-19b可能通過增強PDAC細胞腫瘤干細胞特性促進細胞遷移和侵襲。2.經(jīng)microRNA.org和TargetScan預測miR-19b的靶向mRNA,并結(jié)合前期研究報道中PDAC細胞腫瘤干細胞特性調(diào)控常見分子和信號通路,篩選出3個miR-19b影響PDAC細胞腫瘤干細胞特性的可能分子SOX2、PTEN及ABCG2;經(jīng)Western blotting檢測miR-19b高表達后SOX2、PTEN及ABCG2表達改變,結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有PTEN蛋白表達水平下降,說明miR-19b可能通過靶向作用于PTEN進而影響PDAC細胞腫瘤干細胞特性。3.通過Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)PTEN高表達能夠明顯逆轉(zhuǎn)miR-19b高表達后PDAC細胞腫瘤干細胞特性標志物(CD133、c-Met、FOXM1)的表達增強,經(jīng)sphere formation實驗檢測PTEN高表達能夠逆轉(zhuǎn)miR-19b高表達后PDAC腫瘤干細胞自我更新能力的增強。結(jié)果說明miR-19b可通過降低PTEN表達進而促進PDAC細胞腫瘤干細胞特性。4.經(jīng)Tanswell小室細胞遷移實驗和Matrigel細胞侵襲實驗證實PTEN高表達能夠逆轉(zhuǎn)miR-19b高表達引起的細胞遷移和侵襲能力增強。說明miR-19b可通過靶向作用于PTEN降低其表達進而增強PDAC細胞腫瘤干細胞特性,并進一步促進PDAC細胞侵襲和遷移能力。[結(jié)論]1.miR-19b可通過增強PDAC腫瘤干細胞特性促進腫瘤轉(zhuǎn)移;2.PTEN可介導miR-19b對PDAC腫瘤干細胞特性及轉(zhuǎn)移的調(diào)控作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R576;R735.9

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本文編號：2302492