發(fā)布時(shí)間：2018-10-30 18:41

【摘要】：乳腺癌是嚴(yán)重危害女性健康的最嚴(yán)重的惡性腫瘤之一。其最重要的特點(diǎn)是腫瘤細(xì)胞容易發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移,這也成為導(dǎo)致臨床治療失敗的主要原因。在臨床確診的惡性腫瘤病人中,50%以上的患者其原發(fā)瘤已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移。腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個(gè)多步驟復(fù)雜連續(xù)過程,在這一過程中,腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移與新生血管形成關(guān)系密切,新生血管在為腫瘤的生長提供營養(yǎng)和氧氣的同時(shí)帶走代謝產(chǎn)物,并且使原發(fā)瘤細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)到達(dá)靶器官,為腫瘤的轉(zhuǎn)移提供了必要條件。傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為腫瘤血供模式主要分為血管發(fā)生和血管生成兩種,而兩者的共同特點(diǎn)是都依賴血管內(nèi)皮細(xì)胞。以往的抗血管生成治療主要是以內(nèi)皮細(xì)胞作為靶點(diǎn),而對惡性腫瘤自身圍成的血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry, VM)結(jié)構(gòu)未加以考慮。VM是一種不依賴內(nèi)皮細(xì)胞的全新的腫瘤供血方式,即高侵襲性的腫瘤細(xì)胞在特定微環(huán)境中通過自身變形圍成的管道結(jié)構(gòu)。VM常位于腫瘤內(nèi)部,與病人預(yù)后明顯負(fù)相關(guān)。但是目前對VM的研究尚處于初級階段,許多導(dǎo)致VM形成的分子機(jī)制也不十分明確�，F(xiàn)已知許多因素都可影響VM的形成,例如缺氧的腫瘤微環(huán)境,細(xì)胞外基質(zhì)重塑,腫瘤干細(xì)胞,上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition, EMT)等。腫瘤細(xì)胞的快速生長和增殖需要消耗大量的營養(yǎng)和氧氣,由于新生血管尚未形成,氧氣供應(yīng)不足,腫瘤細(xì)胞處于急性或慢性缺氧狀態(tài)。而缺氧的微環(huán)境可以通過刺激許多信號分子的產(chǎn)生或過表達(dá)促進(jìn)腫瘤VM的形成,例如HIF-1α、VE-Cadherin、MMPs、VEGF等,其中HIF-la可通過啟動一系列信號通路促進(jìn)VM的發(fā)生。這也是乳腺癌治療難以突破的一個(gè)瓶頸,目前臨床常用的抗血管生成藥物主要以內(nèi)皮細(xì)胞做為靶點(diǎn),然而在腫瘤的臨床治療中該類分子靶向抑制劑對腫瘤的治療作用不理想。因此,研發(fā)抗乳腺癌血管生成擬態(tài)的新型治療藥物是目前亟待解決的問題。海藻糖衍生物Brartemicin,結(jié)構(gòu)為6,6’-雙-2,4-二羥基-6-甲基苯甲酸酯-α,α-D-海藻糖,是日本科學(xué)家Igarashi從放線菌Nonomuraea sp.代謝產(chǎn)物中分離得到的。我院藥化所劉兆鵬教授對Brartemicin的分子進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造,構(gòu)建了一系列不同的海藻糖衍生物。經(jīng)篩選,發(fā)現(xiàn)化合物6,6’-雙(2,3-二甲氧基苯甲酰基)-a,a-D-海藻糖(6,6'-bis (2,3-dimethoxybenzoyl)-a, a-D-trehalose, DMBT)抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移活性較好且毒性較低。但其抗侵襲轉(zhuǎn)移作用是否和VM有關(guān)還不清楚。本課題通過體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn),研究化合物DMBT對人乳腺癌血管生成擬態(tài)的作用,并研究其分子機(jī)制,以期得到有效的抗乳腺癌VM藥物。實(shí)驗(yàn)方法：利用連二亞硫酸鈉營造腫瘤缺氧的微環(huán)境,MTT法及克隆形成實(shí)驗(yàn)用來檢測連二亞硫酸鈉的適宜濃度,Western blotting實(shí)驗(yàn)檢測VM相關(guān)蛋HIF-1a,VE-cadherin, MMP-2, MMP-9, VEGE等的表達(dá),用來選定連二亞硫酸鈉合適的作用時(shí)間。劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測缺氧組及DMBT組對乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231及MCF-7細(xì)胞的侵襲和遷移能力的影響。體外3D培養(yǎng)觀察缺氧組及DMBT組對兩種乳腺癌細(xì)胞VM形成能力的影響。PAS/CD34雙染法觀察DMBT體內(nèi)抗VM形成能力。Western blotting實(shí)驗(yàn)檢測缺氧以及缺氧加DMBT對兩種乳腺癌細(xì)胞VM相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：MTT法及克隆形成實(shí)驗(yàn)選定連二亞硫酸鈉1 mmol和0.5 mmol分別作為制造乳腺癌MDA-MB-231及MCF-7細(xì)胞缺氧微環(huán)境的適宜濃度。Western blotting實(shí)驗(yàn)顯示,在MDA-MB-231細(xì)胞中,隨著連二亞硫酸鈉作用時(shí)間的延長,HIF-1α, VE-cadherin, MMP-2, MMP-9和VEGE等表達(dá)逐漸增多,而在MCF-7細(xì)胞中,VM相關(guān)蛋白在4小時(shí)表達(dá)最多,之后逐漸減少。因此選定連二亞硫酸鈉1 mmol作用24 h以及0.5 mmol作用4h分別作為MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞的缺氧條件。劃痕實(shí)驗(yàn)以及Transwell實(shí)驗(yàn)顯示,缺氧能夠促進(jìn)兩種細(xì)胞的遷移和侵襲能力,而DMBT能夠抵抗這種現(xiàn)象。體外3D培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)缺氧能夠促進(jìn)兩種細(xì)胞的VM形成能力,而DMBT可以有效抑制缺氧環(huán)境下的VM形成。PAS/CD34雙染顯示DMBT在1mg/kg、10mg/kg可明顯抑制腫瘤組織中的VM形成。Western blotting實(shí)驗(yàn)顯示,在MDA-MB-231細(xì)胞中,DMBT能夠抑制缺氧環(huán)境下HIF-1α, VE-Cadherin, MMP-2, MMP-9, Rac1及Cdc42的表達(dá)。在MCF-7中,DMBT對VE-Cadherin, MMP-2, VEFG的表達(dá)無影響,但可以抑制HIF-la, Beclinl, Rac1及Cdc42的表達(dá),同時(shí)增加mTOR的表達(dá)。結(jié)論：缺氧的微環(huán)境可以促進(jìn)高、低侵襲性的乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞以及MCF-7細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移以及VM形成,缺氧環(huán)境下DMBT能夠在兩種細(xì)胞內(nèi)通過不同的作用機(jī)制逆轉(zhuǎn)這種現(xiàn)象。在MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi),DMBT主要通過抑制HIF-1 α/VE-cadherin/MMPs信號通路抑制VM的形成,而對VEGF作用不明顯。在MCF-7細(xì)胞,缺氧對HIF-la, VE-cadherin的影響較小,主要通過對自噬相關(guān)蛋白Beclinl,mTOR的調(diào)節(jié)來促進(jìn)VM, DMBT通過抑制Beclin1,促進(jìn)mTOR的表達(dá)抑制自噬,進(jìn)而抑制MCF-7細(xì)胞的VM形成。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.9

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本文編號：2300848