【摘要】：原發(fā)性肝癌(primary carcinoma of the liver,PCL)是臨床上最常見的惡性腫瘤之一,死亡率高,是現(xiàn)代人類健康的巨大威脅。尤其在我國,肝癌的發(fā)病率與死亡率均位居世界前列,并且呈不斷上升趨勢。原發(fā)性肝癌種類很多,主要分為肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)、肝胚細(xì)胞癌(hepatoblastoma)、膽管細(xì)胞癌(cholangiocarcinoma)和肉瘤(sarcoma)等,其中,肝細(xì)胞癌占肝癌的90%以上。肝癌的早期診斷、早期治療對患者的預(yù)后及存活時間至關(guān)重要。甲胎蛋白(alpha fetoprotein,AFP)是1965年發(fā)現(xiàn)并報道的第一個具有診斷價值的肝癌特異性腫瘤標(biāo)志物,也是現(xiàn)有診斷原發(fā)性肝癌的主要臨床標(biāo)志物之一,但是,大量的臨床數(shù)據(jù)卻發(fā)現(xiàn),部分肝硬化患者AFP檢測長期呈陽性,也仍約有30%以上肝癌患者血清AFP檢測呈陰性。近年來,一些肝癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的信號通路得以闡釋清楚,但是,肝癌早期診斷難,晚期預(yù)后差的情況并沒有改變。因此,更加深入地了解肝癌的分子機制,尋找新的腫瘤標(biāo)志物和診斷、治療靶點的需求仍然迫在眉睫。我們在前期研究中,運用消減EMSA-SELEX(Systematic Evolution of Ligands by EXpotential Enrichment)技術(shù),從伴肝外轉(zhuǎn)移的血清AFP陰性肝細(xì)胞癌患者血清中篩選出候選標(biāo)志物分子——VASN(Vasorin,slit like 2)蛋白,并通過實驗證實了VASN在肝癌組織、肝癌細(xì)胞中的表達(dá)水平均高于正常肝組織和正常肝細(xì)胞,且VASN高表達(dá)對肝癌細(xì)胞的增殖、遷移有明顯的促進作用。本課題的主要研究內(nèi)容就是進一步對肝癌中VASN的表達(dá)調(diào)控機制進行探討,課題主要分為以下兩個部分:第一部分:VASN通過外泌體影響人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)的遷移。VASN是一個典型的Ⅰ型跨膜糖蛋白,受去整合素-金屬蛋白酶17(ADAM metallopeptidase domain 17,ADAM17)剪切,分泌至血管循環(huán)中,發(fā)揮TGF-β(Transforming growth factor-beta,TGF-β)結(jié)合蛋白的作用。主要表達(dá)在動脈和富含血管的胎盤與腎臟等器官中。但VASN在正常肝組織、肝細(xì)胞中表達(dá)量很低,在肝癌組織、肝癌細(xì)胞中高表達(dá)。這說明VASN與肝癌發(fā)生發(fā)展有可能有密切關(guān)系。我們首先探索了VASN與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的聯(lián)系。VASN的蛋白結(jié)構(gòu)表明細(xì)胞表達(dá)的VASN可以分泌至細(xì)胞外。我們檢測了Hep G2細(xì)胞的培養(yǎng)上清,檢測發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)上清中含有大量的分泌型VASN。將Hep G2細(xì)胞培養(yǎng)上清與HUVEC共培養(yǎng)后,發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)后HUVEC中VASN的蛋白含量升高,而HUVEC中VASN的m RNA含量沒有發(fā)生變化,提示HUVEC中含量上升的VASN蛋白可能來自于外源肝癌細(xì)胞的分泌。為了找到VASN在胞外的存在形式與功能方式,我們從細(xì)胞培養(yǎng)上清中純化得到外泌體,并對外泌體及細(xì)胞培養(yǎng)上清中的VASN進行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn),外泌體中能檢測到VASN,培養(yǎng)上清中也能檢測到VASN,除去培養(yǎng)上清中的外泌體后VASN的含量明顯下降。以上結(jié)果證明VASN能夠存在于外泌體中。檢測不同肝細(xì)胞系外泌體VASN后發(fā)現(xiàn),肝癌細(xì)胞Hep G2的外泌體VASN明顯高于正常肝細(xì)胞L02與HUVEC的外泌體VASN。這與細(xì)胞內(nèi)VASN的表達(dá)差異一致。這說明不同細(xì)胞外泌體VASN的含量與不同細(xì)胞中VASN的表達(dá)差別是一致的。收集Hep G2細(xì)胞培養(yǎng)上清中的外泌體,濃縮后以高濃度加入HUVEC培養(yǎng)基共培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)同樣能在HUVEC細(xì)胞中檢測到VASN。為了進一步證明外泌體VASN的轉(zhuǎn)運,我們在Hep G2中過表達(dá)帶myc標(biāo)簽的VASN,純化收集帶有myc標(biāo)簽的外泌體,隨后將帶myc標(biāo)簽的外泌體與HUVEC細(xì)胞孵育進行免疫熒光共定位實驗,實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),帶標(biāo)簽的外源VASN能在HUVEC細(xì)胞被檢出。這表明,HUVEC中VASN水平的升高確實是攝取Hep G2來源的外泌體VASN而產(chǎn)生的。我們將Hep G2細(xì)胞培養(yǎng)上清及Hep G2來源的外泌體與HUVEC共培養(yǎng),結(jié)果發(fā)現(xiàn)能夠引起HUVEC遷移加快,但HUVEC增殖水平未見明顯變化。這說明了,Hep G2來源的外泌體可作用于靶細(xì)胞并引起靶細(xì)胞功能改變。隨后的實驗中,我們通過改變Hep G2細(xì)胞的VASN水平,從而改變外泌體中VASN的含量。用VASN含量不同的外泌體與靶細(xì)胞HUVEC共培養(yǎng),進而引起了共培養(yǎng)細(xì)胞HUVEC的遷移功能變化。這結(jié)果進一步說明了外泌體引起的靶細(xì)胞功能改變與外泌體內(nèi)VASN的含量密切相關(guān),VASN很有可能是一個重要的細(xì)胞因子,通過外泌體的轉(zhuǎn)運,在腫瘤細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞間傳遞信息,發(fā)揮其生物學(xué)功能。第二部分:mi R-152靶向ADAM17抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移。ADAM17是ADAM家族成員之一,它能夠作為金屬蛋白酶激活腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)脫落分泌,同樣也是VASN的重要調(diào)控分子。報道發(fā)現(xiàn),ADAM17將膜型VASN的胞外區(qū)剪切脫落后,胞外區(qū)分泌至血液循環(huán)中作為分泌型VASN發(fā)揮生物學(xué)功能。近年來,越來越多的報道發(fā)現(xiàn)腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲與mi RNAs之間具有密切聯(lián)系,mi RNAs通過調(diào)節(jié)細(xì)胞連接、細(xì)胞外基質(zhì)降解、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transformation,EMT)、血管形成等相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)揮調(diào)控腫瘤發(fā)展的作用。因此,我們研究了mi RNAs對ADAM17的調(diào)控機制。生物信息學(xué)預(yù)測提示,ADAM17可能是mi R-152的靶基因之一,我們構(gòu)建了包含及缺失mi R-152靶位點的ADAM17的3′-UTR熒光素酶報告基因載體,進行了雙熒光素酶報告基因檢測,發(fā)現(xiàn)mi R-152 mmics能結(jié)合并下調(diào)含有其結(jié)合位點的報告基因的熒光素酶活性,而對突變體沒有影響。過表達(dá)mi R-152對ADAM17m RNA水平及蛋白水平均有負(fù)調(diào)節(jié)作用。在低氧狀態(tài)下,mi R-152受低氧環(huán)境影響低表達(dá),引起ADAM17表達(dá)升高,進而導(dǎo)致TNF-α脫落增多。用si RNA沉默ADAM17的表達(dá),也能抑制肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移,與mi R-152過表達(dá)的效果類似。從而證實了mi R-152在轉(zhuǎn)錄水平負(fù)性調(diào)控ADAM17,影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖與遷移。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.7

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本文編號：2296808