【摘要】：前言腦膠質(zhì)瘤是人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的腫瘤之一,在成人和兒童50-60%的顱內(nèi)腫瘤都是腦膠質(zhì)瘤,腦膠質(zhì)瘤發(fā)生率大概6.42例/100000。腦膠質(zhì)瘤患者5年存活率不到30%。雖然腦膠質(zhì)瘤的治療方法有了長足的進展,但是高級別腦膠質(zhì)瘤惡性程度較高,治療療效卻沒有顯著改善。腦膠質(zhì)瘤易復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的這種生物學(xué)行為越來越受到廣泛關(guān)注,因此,進一步探索研究與腦膠質(zhì)瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的新的機制,對深入進行腦膠質(zhì)瘤綜合治療,提高患者預(yù)后有重要意義。研究表明細胞骨架在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用,其主要成分微管的減少及解聚與惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān)。而驅(qū)動蛋白在微管解聚和聚合過程中起到重要作用。驅(qū)動蛋白超家族具有馬達催化區(qū)和ATP結(jié)合區(qū),能轉(zhuǎn)化水解ATP的化學(xué)能成機械能。驅(qū)動蛋白超家族可參與細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運、染色體分離、有絲分裂、紡錘體和中體形成等胞內(nèi)重要的生命過程。隨著研究深入,迄今為止發(fā)現(xiàn)了45種驅(qū)動蛋白,分為14個家族。其中Kinesin-13家族蛋白主要參與細胞的有絲分裂,特別是紡錘體形成,染色體和核運動及胞質(zhì)分裂過程。研究證實Kinesin-13家族成員之一Kif2a能通過解聚微管蛋白的功能,在調(diào)控雙極紡錘體的形成、中心紡錘體長度及方向過程中及抑制神經(jīng)元中副側(cè)枝的延伸過程中發(fā)揮重要作用。過度激活或抑制Kif2a可影響染色體間微管長度,紊亂中心染色體,導(dǎo)致有絲分裂異常。近年來,一些研究機構(gòu)相繼發(fā)現(xiàn)Kif2a在口腔癌、乳腺癌及結(jié)直腸癌組織中表達上調(diào)。并在口腔癌、乳腺癌等腫瘤細胞的遷移和侵襲過程中發(fā)揮重要作用。但迄今為止,Kif2a在腦膠質(zhì)瘤中的表達及及其與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系尚不明確。本研究首次探討了Kif2a基因在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達情況；并通過體外實驗研究了Kif2a基因在腦膠質(zhì)瘤細胞遷移,侵襲,增殖和凋亡中的作用及分子機制；最后初步探討了Kif2a基因和在腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移過程中起到非常重要作用的HIF1α基因的關(guān)系。實驗結(jié)果表明Kif2a基因在腦膠質(zhì)瘤細胞的遷移,侵襲,增殖和凋亡過程中有發(fā)揮了重要的作用。鑒于Kif2a基因在腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移過程中的重要作用,提示可將其作為腦膠質(zhì)瘤治療的新的潛在靶點。第一部分Kif2a在腦膠質(zhì)瘤中的表達及意義目的研究Kif2a在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達及臨床意義。方法標(biāo)本收集：收集遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院2008～2013年間原發(fā)性腦膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本35例,另收集2014年山東大學(xué)齊魯醫(yī)院神經(jīng)外科住院患者手術(shù)切除的新鮮腦膠質(zhì)瘤組織35例,作為實驗組。且所有患者術(shù)前均未進行放療、化療等其他治療,并與患者或監(jiān)護人簽署實驗知情同意書后進入實驗進行研究。同時取20例正常尸檢的腦組織標(biāo)本做為對照組。所有入組組織標(biāo)本按照WHO(2000)標(biāo)準(zhǔn)進行分級,Ⅰ-Ⅱ級15例,Ⅲ-Ⅳ級20例；男23例,女12例；平均年齡(4-70歲)。1.應(yīng)用免疫組化法檢測高級別的腦膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織,不同級別的腦膠質(zhì)瘤組織Kif2a蛋白的表達情況。探討在高級別腦膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織及不同級別的腦膠質(zhì)瘤組織中Kif2a蛋白的表達情況及相互關(guān)系。2.應(yīng)用Real-time PCR法檢測新鮮腦膠質(zhì)瘤組織中Kif2a的mRNA表達情況與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。探討在不同級別腦膠質(zhì)瘤組織中Kif2a的mRNA表達情況及相互關(guān)系。結(jié)果免疫組化結(jié)果顯示35例高級別腦膠質(zhì)瘤組織和20例正常腦組織中都有Kif2a的陽性表達,與正常腦組織比較,高級別腦膠質(zhì)瘤組織表達率高于正常腦組織,且有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.001)。免疫組化檢測35例不同級別的腦膠質(zhì)瘤組織,高級別腦膠質(zhì)瘤組織表達率高于低級別腦膠質(zhì)瘤(P=0.044)。Kif2a蛋白主要表達在胞質(zhì)及胞核,呈棕黃色顆粒,在高級別腦膠質(zhì)瘤細胞胞漿中染色較強,在低級別腦膠質(zhì)瘤細胞和正常腦組織細胞中染色較淺。Real-time PCR法檢測新鮮膠質(zhì)瘤組織中Kif2a的mRNA表達。Kif2a表達隨著腦膠質(zhì)瘤級別增高而增強(P=0.033)。結(jié)論Kif2a在高級別腦膠質(zhì)瘤中強表達,在低級別腦膠質(zhì)瘤和正常腦組織弱表達。Kif2a的表達水平與腦膠質(zhì)瘤的病理分級,臨床分期相關(guān)。第二部分Kif2a基因沉默對腦膠質(zhì)瘤A172增殖、凋亡、侵襲/遷移的影響目的探討siRNA介導(dǎo)的Kif2a基因沉默對腦膠質(zhì)瘤A172細胞系細胞增殖、凋亡及侵襲遷移能力的影響；探討Kif2a基因沉默后抑制人膠質(zhì)瘤細胞生長、侵襲及轉(zhuǎn)移的分子機制。方法1.人腦膠質(zhì)瘤細胞株篩選：腦膠質(zhì)瘤細胞系A(chǔ)172和U251細胞常規(guī)進行復(fù)蘇,傳代,獲取細胞,37℃,5%CO2飽和濕度條件下,在含10%胎牛血清和DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng),提取A172和U251細胞的總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,進行PCR擴增,確定人腦膠質(zhì)瘤A172細胞作為研究對象。2.質(zhì)粒干擾率的測定：將細胞分Kif2a siRNA組和scrambled siRNA對照組,將對數(shù)生長期的A172細胞以2×105數(shù)目接種于6孔培養(yǎng)板中。用脂質(zhì)體liPofectamine2000分別轉(zhuǎn)染Kif2a siRNA和scrambled siRNA。轉(zhuǎn)染后48h,收集細胞,提取細胞總RNA和總蛋白,應(yīng)用RT-PCR方法檢測不同實驗組中Kif2a的基因表達。應(yīng)用Western-blot方法檢測不同實驗組中Kif2a的蛋白表達。分析不同實驗組中A172細胞Kif2a的基因、蛋白表達情況。評價Kif2a siRNA組干擾效率。3.利用CCK8檢測Kif2a基因沉默對腦人膠質(zhì)瘤細胞系A(chǔ)172細胞增殖能力的影響：分別將指數(shù)生長期A172-Kif2a siRNA組和對照組細胞消化計數(shù)后按1×104個/孔接種于96孔細胞培養(yǎng)板中,培養(yǎng)3天,于第0、24、48和72h,采用CCK8方法檢測各組細胞增殖情況。4.流式細胞術(shù)檢測Kif2a基因沉默對人腦膠質(zhì)瘤細胞系A(chǔ)172細胞的凋亡率變化：取各組細胞消化計數(shù)后按2×105/孔接種于12孔板中,待細胞融合至約80%,收集細胞,Annexin V和PI染色后流式細胞儀檢測細胞凋亡率變化。5.Transwell小室細胞侵襲實驗檢測Kif2a基因沉默對人腦膠質(zhì)瘤細胞系A(chǔ)172細胞侵襲遷移能力的影響。取各組無血清A172細胞懸液100μL加入小室的上室,下室加入600μl含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,培養(yǎng)16h。光鏡下計數(shù)侵襲到濾膜背面的穿膜細胞數(shù),評價細胞的侵襲遷移能力。6.明膠酶譜法檢測Kif2a基因沉默對人腦膠質(zhì)瘤細胞A172細胞MMP2、MMP9的表達的影響。7.Western blot檢測Kif2a基因沉默對人腦膠質(zhì)瘤細胞系A(chǔ)172細胞PI3K/AKT和MAPK/ERK信號通路的影響。8.Western blot檢測Kif2a基因沉默對人腦膠質(zhì)瘤A172細胞MMP2、MMP9蛋白表達的影響。結(jié)果1. Kif2a siRNA能夠有效下調(diào)Kif2a的表達。qRT-PCR檢測Kif2a siRNA敲除24h,48h時A172細胞中Kif2a的表達,發(fā)現(xiàn)48h的敲除效率高(P=0.003)。Western blot進一步驗證A172細胞中Kif2a siRNA較對照組敲除48h時的效率高。2.CCK8法檢測Kif2a敲除對A172細胞增殖的影響。發(fā)現(xiàn)隨著時間延長,A172細胞Kif2a siRNA敲除組增殖率顯著低于對照組。3. Annexin V/PI法檢測Kif2a siRNA及scrambled siRNA兩組敲除48h時A172細胞凋亡率。發(fā)現(xiàn)Kif2a敲除組較對照組相比,Kif2a敲除組顯著上調(diào)A172的凋亡率(P0.0001)。4.Tanswell小室細胞侵襲實驗結(jié)果顯示Kif2a siRNA敲除組A172細胞侵襲/遷移顯著低于對照組。5.明膠酶譜檢測發(fā)現(xiàn)Kif2a siRNA敲除組上清中MMP2、MMP9的活性顯著低于scrambled siRNA組。6.Western blot分析發(fā)現(xiàn)Kif2a siRNA敲除組中,與膠質(zhì)瘤細胞侵襲、遷移相關(guān)的AKT磷酸化水平下調(diào)；MMP2蛋白表達水平下調(diào)。與膠質(zhì)瘤細胞增殖相關(guān)的p38MAPK磷酸化水平下調(diào)。結(jié)論1.Kif2a siRNA能夠有效的抑制A172細胞中Kif2a的表達,Kif2a基因沉默后A172細胞增殖、侵襲和遷移能力明顯降低,凋亡水平升高。2.Kif2a通過PI3K/AKT和MAPK/ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腦膠質(zhì)瘤細胞的惡性生物學(xué)行為中起著重要的作用。3. Kif2a通過MMP調(diào)控人腦膠質(zhì)瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力。第三部分HIFla在腦膠質(zhì)瘤中的表達和意義及和Kif2a的關(guān)系目的研究HIFla在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達及臨床意義,并分析其與Kif2a之間的關(guān)系。方法收集山東大學(xué)齊魯醫(yī)院神經(jīng)外科2013-2014年住院患者手術(shù)切除的新鮮腦膠質(zhì)瘤組織35例,所有標(biāo)本病理證實是人腦膠質(zhì)瘤組織并制備成石蠟切片,所有患者均為原發(fā)性,術(shù)前未行放療、化療和其他治療,所有患者及監(jiān)護人被告知進行實驗。所有患者組織標(biāo)本診斷按照WHO(2000)標(biāo)準(zhǔn)進行分級,Ⅰ-Ⅱ級15例,Ⅲ-Ⅳ級20例；男23例,女12例；平均年齡(4-70歲)。應(yīng)用免疫組化法檢測不同級別的腦膠質(zhì)瘤組織HIF1α蛋白的表達情況。檢測在不同級別的腦膠質(zhì)瘤組織中HIF1α蛋白的表達情況,并探討Kif2a與HIF1α在腦膠質(zhì)瘤組織中表達相關(guān)性。結(jié)果1.HIF1α蛋白表達與臨床資料之間的關(guān)系。免疫組化結(jié)果顯示HIF1α蛋白主要在細胞核和細胞漿中染色。35例腦膠質(zhì)瘤組織中HIF1α蛋白的陽性表達率是68.6%,20例Ⅲ-Ⅳ腦膠質(zhì)瘤切片中,17(85.3%)例表達陽性,3(14.7%)例陰性表達。15例Ⅰ-Ⅱ腦膠質(zhì)瘤切片中,7(46.7%)例表達陽性,8(53.3%)例陰性表達。HIF1α蛋白在Ⅰ-Ⅱ低級別和Ⅲ-Ⅳ高級別腦膠質(zhì)瘤表達有差異性(P=0.027)。HIF1α在腦膠質(zhì)瘤中的表達隨著腫瘤級別增高而成上升趨勢(P0.05),HIF1α在腦膠質(zhì)瘤表達與患者年齡,性別、腫瘤大小及發(fā)生部位無關(guān)。2.Kif2a和HIF1α蛋白在腦膠質(zhì)瘤組織中表達相關(guān)性。免疫組化檢測腦膠質(zhì)瘤中Kif2a和HIF1α蛋白表達無差異性(P=0.33)。結(jié)論HIF1α蛋白在高級別腦膠質(zhì)瘤中強表達,在低級別腦膠質(zhì)瘤弱表達。HIF1α的表達水平與腦膠質(zhì)瘤的病理分級,臨床分期相關(guān)。HIF1α蛋白可作為評價腦膠質(zhì)瘤臨床指標(biāo)的一個重要因子。Kif2a和HIF1α蛋白在腦膠質(zhì)瘤的轉(zhuǎn)移過程中均可能化起到正調(diào)控作用,但兩者之間可能不存在相關(guān)性,其機制尚待進一步研究明確。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R739.4

【共引文獻】

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本文編號：2295673