【摘要】：研究背景： RUNX1，也叫做AML1（acute myeloid leukemia1），位于人第21號(hào)染色體，是AML突變中最常累及的基因。t(8;21)轉(zhuǎn)位是最常見(jiàn)的RUNX1相關(guān)的染色體轉(zhuǎn)位，t（8;21）轉(zhuǎn)位后，RUNX1基因的前半部分和幾乎整個(gè)ETO基因融合，其表達(dá)的AML1/ETO融合蛋白具有重要的病理生理活性。研究發(fā)現(xiàn)，21三體綜合征（T21）患兒發(fā)生白血病的風(fēng)險(xiǎn)是正常小孩的10-20倍，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，當(dāng)RUNX1/ETO轉(zhuǎn)位合并其他白血病基因突變（如，C-kit、HIP1-PDFβR）時(shí)，小鼠能被迅速誘導(dǎo)出白血病。越來(lái)越多的證據(jù)表明，RUNX1/ETO融合蛋白是使患者向白血病惡性轉(zhuǎn)化的重要促進(jìn)因素。盡管RUNX1在白血病的發(fā)生和發(fā)展中起著如此重要的作用，然而，我們對(duì)RUNX1/ETO轉(zhuǎn)位的發(fā)生以及RUNX1/ETO融合蛋白表達(dá)的調(diào)控機(jī)制依然不甚了解。因此對(duì)t(8;21)轉(zhuǎn)位發(fā)生機(jī)制的研究，有可能為AML治療提供新的思路。 作者在研究染色體轉(zhuǎn)位時(shí)發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)一條由RUNX1上游啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄，并與RUNX1基因重疊的全新長(zhǎng)鏈非編碼RNA（RUNX1overlapping long non-codingRNA，以下簡(jiǎn)稱為RUNXOR），初步研究發(fā)現(xiàn)，該LncRNA能同時(shí)結(jié)合RUNX1的啟動(dòng)子和基因調(diào)節(jié)序列，并和RUNX1轉(zhuǎn)位相關(guān)基因的染色體易斷裂區(qū)特異性結(jié)合，提示該LncRNA具有重要的基因調(diào)節(jié)功能，并可能介導(dǎo)RUNX1染色體轉(zhuǎn)位的發(fā)生。 研究目的： 本研究擬從長(zhǎng)鏈非編碼RNA RUNXOR的結(jié)構(gòu)入手，以初步明確其在染色體上的位置、基因長(zhǎng)度、轉(zhuǎn)錄方向及啟動(dòng)子序列等；在此基礎(chǔ)上采用染色體構(gòu)象分析、逆轉(zhuǎn)錄相關(guān)捕獲及染色質(zhì)免疫共沉淀等方法，對(duì)RUNXOR的功能片段進(jìn)行初步篩查；對(duì)RUNXOR功能片段與DNA序列及蛋白質(zhì)因子的相互及結(jié)合情況進(jìn)行研究，初步探討其在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)及染色體轉(zhuǎn)位中的功能及作用機(jī)制，為白血病的病因?qū)W研究、臨床治療及預(yù)后判斷提供新的理論依據(jù)。 研究方法： ①應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，，RT-PCR）對(duì)RUNXOR的全長(zhǎng)進(jìn)行初步定位；②采用鏈特異性逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（strand specific reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR，SSRT-PCR）確定其轉(zhuǎn)錄方向；③使用螢光素酶-綠色熒光蛋白報(bào)告基因檢測(cè)法測(cè)定其啟動(dòng)子活性；④應(yīng)用定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative reverse transcription PCR，RT-qPCR）法比較分析RUNXOR在正常骨髓和急性髓系白血病患者骨髓中的差異性表達(dá)；⑤使用染色體構(gòu)象捕獲法（chromosome conformation capture，3C）研究RUNXOR介導(dǎo)的染色體內(nèi)環(huán)狀結(jié)構(gòu)的形成（intra-chromosome looping）；⑥采用逆轉(zhuǎn)錄相關(guān)捕獲法（Reverse transcription associated trap assay）研究RUNXOR與DNA之間的結(jié)合關(guān)系；⑦RNA免疫共沉淀法（RNA immunoprecipitation，RIP）分析及染色質(zhì)免疫共沉淀法（chromatin immunoprecipitation，ChIP）研究RUNXOR與調(diào)節(jié)蛋白因子之間的結(jié)合關(guān)系。 研究結(jié)果： ①RUNXOR啟動(dòng)子位于RUNX1啟動(dòng)子上游3.8kb左右，該LncRNA全長(zhǎng)約216kb，其部分序列與RUNX1基因重疊，轉(zhuǎn)錄方向和RUNX1一致，并主要定位于細(xì)胞核內(nèi)；②RUNXOR在急性髓系白血病患者骨髓中的表達(dá)量高于正常骨髓樣本（P0.05）；③阿糖胞苷（cytosine arabinoside，Ara-C）處理后白血病細(xì)胞株后，其RUNXOR表達(dá)升高（P0.05）；④RUNXOR通過(guò)其3’端RNA序列結(jié)合RUNX1啟動(dòng)子及增強(qiáng)子結(jié)合；⑤RUNXOR通過(guò)其RNA序列與RUNX1蛋白和H3K27甲基化酶EZH2結(jié)合；⑥RUNXOR通過(guò)其3’端RNA序列結(jié)合3號(hào)染色體的EVI1、8號(hào)染色體的ETO及21號(hào)染色體RUNX1的染色體易斷裂區(qū)（轉(zhuǎn)位高發(fā)區(qū)） 研究結(jié)論： ①本研究發(fā)現(xiàn)了一條由RUNX1上游啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄，并與RUNX1基因重疊的全新長(zhǎng)鏈非編碼RNA(RUNX1overlapping long non-coding RNA， RUNXOR)，其轉(zhuǎn)錄方向和RUNX1一致，跨度超過(guò)216kb，該LncRNA主要位于細(xì)胞核內(nèi)，提示其主要功能為基因轉(zhuǎn)錄及調(diào)控；②RUNXOR在白血病細(xì)胞株及白血病患者骨髓中高表達(dá)，考慮該LncRNA和白血病的惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)；③RUNXOR結(jié)合RUNX1啟動(dòng)子并可能通過(guò)募集H3K27甲基化酶EZH2等組蛋白調(diào)節(jié)因子對(duì)RUNX1基因進(jìn)行表觀遺傳學(xué)調(diào)控；④RUNXOR通過(guò)其3’端序列與RUNX1的近端、遠(yuǎn)端啟動(dòng)子及增強(qiáng)子結(jié)合，并參與RUNX1染色體內(nèi)環(huán)狀結(jié)構(gòu)（Intra chromosome looping）的形成；⑤RUNXOR通過(guò)其3’端RNA序列結(jié)合3號(hào)染色體的EVI1、8號(hào)染色體的ETO和21號(hào)染色體的RUNX1基因易斷裂區(qū)，可能通過(guò)改變?nèi)旧w空間構(gòu)象，參與染色體轉(zhuǎn)位的發(fā)生。 創(chuàng)新點(diǎn)： 本課題所研究的RUNXOR是一條新發(fā)現(xiàn)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA，初步研究結(jié)果提示：RUNXOR通過(guò)其3’端序列結(jié)合RUNX1的近端、遠(yuǎn)端啟動(dòng)子及調(diào)節(jié)序列，并可能通過(guò)介導(dǎo)染色體內(nèi)環(huán)狀結(jié)構(gòu)的形成及募集染色質(zhì)調(diào)節(jié)因子等方式，表觀遺傳調(diào)控RUNX1的表達(dá)；RUNXOR能同時(shí)連接3個(gè)和RUNX1轉(zhuǎn)位相關(guān)的基因的染色體易斷裂區(qū)，并可能通過(guò)染色體支架功能，橋接原本空間結(jié)構(gòu)不相鄰的基因，為染色體轉(zhuǎn)位的發(fā)生提供先決條件，此假說(shuō)的提出在國(guó)際上尚未見(jiàn)報(bào)道。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R733.71

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2295315