【摘要】：研究背景： RUNX1，也叫做AML1（acute myeloid leukemia1），位于人第21號染色體，是AML突變中最常累及的基因。t(8;21)轉位是最常見的RUNX1相關的染色體轉位，t（8;21）轉位后，RUNX1基因的前半部分和幾乎整個ETO基因融合，其表達的AML1/ETO融合蛋白具有重要的病理生理活性。研究發(fā)現，21三體綜合征（T21）患兒發(fā)生白血病的風險是正常小孩的10-20倍，動物實驗也證實，當RUNX1/ETO轉位合并其他白血病基因突變（如，C-kit、HIP1-PDFβR）時，小鼠能被迅速誘導出白血病。越來越多的證據表明，RUNX1/ETO融合蛋白是使患者向白血病惡性轉化的重要促進因素。盡管RUNX1在白血病的發(fā)生和發(fā)展中起著如此重要的作用，然而，我們對RUNX1/ETO轉位的發(fā)生以及RUNX1/ETO融合蛋白表達的調控機制依然不甚了解。因此對t(8;21)轉位發(fā)生機制的研究，有可能為AML治療提供新的思路。 作者在研究染色體轉位時發(fā)現發(fā)現一條由RUNX1上游啟動子轉錄，并與RUNX1基因重疊的全新長鏈非編碼RNA（RUNX1overlapping long non-codingRNA，以下簡稱為RUNXOR），初步研究發(fā)現，該LncRNA能同時結合RUNX1的啟動子和基因調節(jié)序列，并和RUNX1轉位相關基因的染色體易斷裂區(qū)特異性結合，提示該LncRNA具有重要的基因調節(jié)功能，并可能介導RUNX1染色體轉位的發(fā)生。 研究目的： 本研究擬從長鏈非編碼RNA RUNXOR的結構入手，以初步明確其在染色體上的位置、基因長度、轉錄方向及啟動子序列等；在此基礎上采用染色體構象分析、逆轉錄相關捕獲及染色質免疫共沉淀等方法，對RUNXOR的功能片段進行初步篩查；對RUNXOR功能片段與DNA序列及蛋白質因子的相互及結合情況進行研究，初步探討其在基因轉錄調節(jié)及染色體轉位中的功能及作用機制，為白血病的病因學研究、臨床治療及預后判斷提供新的理論依據。 研究方法： ①應用逆轉錄-聚合酶鏈反應（reverse transcription polymerase chain reaction，，RT-PCR）對RUNXOR的全長進行初步定位；②采用鏈特異性逆轉錄-聚合酶鏈反應（strand specific reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR，SSRT-PCR）確定其轉錄方向；③使用螢光素酶-綠色熒光蛋白報告基因檢測法測定其啟動子活性；④應用定量聚合酶鏈反應（quantitative reverse transcription PCR，RT-qPCR）法比較分析RUNXOR在正常骨髓和急性髓系白血病患者骨髓中的差異性表達；⑤使用染色體構象捕獲法（chromosome conformation capture，3C）研究RUNXOR介導的染色體內環(huán)狀結構的形成（intra-chromosome looping）；⑥采用逆轉錄相關捕獲法（Reverse transcription associated trap assay）研究RUNXOR與DNA之間的結合關系；⑦RNA免疫共沉淀法（RNA immunoprecipitation，RIP）分析及染色質免疫共沉淀法（chromatin immunoprecipitation，ChIP）研究RUNXOR與調節(jié)蛋白因子之間的結合關系。 研究結果： ①RUNXOR啟動子位于RUNX1啟動子上游3.8kb左右，該LncRNA全長約216kb，其部分序列與RUNX1基因重疊，轉錄方向和RUNX1一致，并主要定位于細胞核內；②RUNXOR在急性髓系白血病患者骨髓中的表達量高于正常骨髓樣本（P0.05）；③阿糖胞苷（cytosine arabinoside，Ara-C）處理后白血病細胞株后，其RUNXOR表達升高（P0.05）；④RUNXOR通過其3’端RNA序列結合RUNX1啟動子及增強子結合；⑤RUNXOR通過其RNA序列與RUNX1蛋白和H3K27甲基化酶EZH2結合；⑥RUNXOR通過其3’端RNA序列結合3號染色體的EVI1、8號染色體的ETO及21號染色體RUNX1的染色體易斷裂區(qū)（轉位高發(fā)區(qū)） 研究結論： ①本研究發(fā)現了一條由RUNX1上游啟動子轉錄，并與RUNX1基因重疊的全新長鏈非編碼RNA(RUNX1overlapping long non-coding RNA， RUNXOR)，其轉錄方向和RUNX1一致，跨度超過216kb，該LncRNA主要位于細胞核內，提示其主要功能為基因轉錄及調控；②RUNXOR在白血病細胞株及白血病患者骨髓中高表達，考慮該LncRNA和白血病的惡性轉化有關；③RUNXOR結合RUNX1啟動子并可能通過募集H3K27甲基化酶EZH2等組蛋白調節(jié)因子對RUNX1基因進行表觀遺傳學調控；④RUNXOR通過其3’端序列與RUNX1的近端、遠端啟動子及增強子結合，并參與RUNX1染色體內環(huán)狀結構（Intra chromosome looping）的形成；⑤RUNXOR通過其3’端RNA序列結合3號染色體的EVI1、8號染色體的ETO和21號染色體的RUNX1基因易斷裂區(qū)，可能通過改變染色體空間構象，參與染色體轉位的發(fā)生。 創(chuàng)新點： 本課題所研究的RUNXOR是一條新發(fā)現的長鏈非編碼RNA，初步研究結果提示：RUNXOR通過其3’端序列結合RUNX1的近端、遠端啟動子及調節(jié)序列，并可能通過介導染色體內環(huán)狀結構的形成及募集染色質調節(jié)因子等方式，表觀遺傳調控RUNX1的表達；RUNXOR能同時連接3個和RUNX1轉位相關的基因的染色體易斷裂區(qū)，并可能通過染色體支架功能，橋接原本空間結構不相鄰的基因，為染色體轉位的發(fā)生提供先決條件，此假說的提出在國際上尚未見報道。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R733.71

【共引文獻】

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本文編號：2295315