【摘要】：背景胃癌是世界范圍內(nèi)因腫瘤死亡的第二大原因,為了更好地診斷與治療胃癌,確定導(dǎo)致該疾病的發(fā)展與惡化的基因及其相關(guān)機(jī)制至關(guān)重要。一些研究顯示,TRIM29是胃癌的一個(gè)重要致癌基因,并且TRIM29 mRNA的過量表達(dá)與不良預(yù)后和更低的生存率有關(guān)。然而,胃癌中TRIM29的作用機(jī)制大部分仍不清楚。RNA干擾技術(shù)是近些年來發(fā)現(xiàn)的一種特異性高且操作簡(jiǎn)單的基因RNA轉(zhuǎn)錄阻斷技術(shù)。在本研究中,我們?cè)囍ㄟ^應(yīng)用Real time qRT-PCR技術(shù)、Western-blot技術(shù)以及siRNA干擾技術(shù)檢測(cè)患者胃癌組織中TRIM29基因和蛋白質(zhì)的水平表達(dá)變化,從而為闡釋胃癌患者中TRIM29表達(dá)與臨床和預(yù)后的關(guān)系提供依據(jù)。目的1.探討TRIM29的表達(dá)與胃癌患者臨床和預(yù)后的關(guān)系。2.通過siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,抑制過表達(dá)TRIM29的細(xì)胞,分析TRIM29在胃癌細(xì)胞中的作用機(jī)制。3.在裸鼠實(shí)驗(yàn)中,通過分析抑制過表達(dá)TRIM29細(xì)胞的成瘤情況,探討TRIM29的表達(dá)水平變化對(duì)胃癌細(xì)胞的影響。方法1.收集2010年3月到2015年1月我院收治的胃腺癌患者38例,分為新輔助化療組(16例)和直接手術(shù)組(22例),收集術(shù)前胃鏡活檢標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)D2切除手術(shù)的胃癌原發(fā)灶標(biāo)本、淋巴結(jié)標(biāo)本及正常胃黏膜,比較上述標(biāo)本中TRIM29的1nRNA表達(dá)和蛋白質(zhì)水平的變化,分析其原因。2.在不同胃癌細(xì)胞株中檢測(cè)TRIM29 mRNA和蛋白表達(dá)水平,挑選過表達(dá)的胃癌細(xì)胞株,轉(zhuǎn)染siRNA質(zhì)粒后,使用Real time qRT-PCR和 Westernblot技術(shù)檢測(cè)TRIM29、P53以及B-catenin的表達(dá)水平；MTT法檢測(cè)細(xì)胞倍增時(shí)間并繪制生長曲線,流式細(xì)胞技術(shù)分析干擾前后細(xì)胞周期的分布。3.選擇TRIM29過表達(dá)的胃癌細(xì)胞,轉(zhuǎn)染siRNA質(zhì)粒,移植于裸鼠皮下,觀察移植腫瘤的大小與生長情況,并檢測(cè)TRIM29的表達(dá)水平變化。結(jié)果1. Real-time qRT-PCR 與 Western-blot結(jié)果提示胃癌原發(fā)灶標(biāo)本、陽性淋巴結(jié)標(biāo)本中TRIM29 mRNA和蛋白水平表達(dá)顯著高于正常胃黏膜、陰性淋巴結(jié)標(biāo)本(P均0.001)。在直接手術(shù)組和新輔助化療組中,TRIM29表達(dá)陽性患者的平均生存時(shí)間均顯著低于TRIM29表達(dá)陰性的患者(Log-rank x2=4.068; P=0.044; Log-rank x2=7.487; P=0.006)。TRIM29日性患者新輔助化療后mRNA的表達(dá)水平明顯低于化療前。2.不同胃癌細(xì)胞株中TRIM29的nRNA和蛋白質(zhì)水平均發(fā)現(xiàn)有不同程度表達(dá)增高。p53的表達(dá)在TRIM29陽性表達(dá)的不同胃癌細(xì)胞株中均出現(xiàn)了明顯下調(diào),而B-catenin則出現(xiàn)了異常高表達(dá)。RNA干擾后,轉(zhuǎn)染siRNA質(zhì)粒的胃癌細(xì)胞株中TRIM29mRNA和蛋白表達(dá)水平降低,顯著低于轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒的細(xì)胞。p53基因mRNA及其蛋白表達(dá)水平顯著高于RNA干擾前,B-catenin基因mRNA及其蛋白表達(dá)水平顯著低于干擾前。與RNA干擾前相比,TRIM29日性表達(dá)的胃癌細(xì)胞株在RNA干擾后細(xì)胞增殖能力顯著降低。3. siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染前TRIM29過表達(dá)的胃癌細(xì)胞在5只裸鼠皮下生長60天內(nèi)均出現(xiàn)轉(zhuǎn)移瘤,腫瘤直徑大小0.4～1.9cm,而siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后TRIM29過表達(dá)的胃癌細(xì)胞在4只裸鼠發(fā)現(xiàn)實(shí)體腫瘤,直徑大小0.1-0.5cm(P0.001),1只未發(fā)現(xiàn)肉眼可見實(shí)體腫瘤。TRIM29mRNA和蛋白水平在siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染前TRIM29過表達(dá)的胃癌細(xì)胞在裸鼠皮下形成的轉(zhuǎn)移瘤中的表達(dá)顯著高于siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后。結(jié)論1.胃癌患者病理組織中TRIM29的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高；TRIM29表達(dá)陽性的患者生存時(shí)間更短,預(yù)后更差。新輔助化療可在一定程度上影響TRIM29的表達(dá)水平。2TRIM29是通過下調(diào)p53,提升β-catenin水平來達(dá)到增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞增殖能力的生物學(xué)作用。3.通過裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了TRIM29可提升胃癌細(xì)胞的增殖能力。
[Abstract]:BACKGROUND OF THE INVENTION Gastric cancer is the second major cause of death in the world. For better diagnosis and treatment of gastric cancer, it is essential to determine the gene and its associated mechanism leading to the development and deterioration of the disease. Some studies have shown that TRIM29 is an important oncogenic gene in gastric cancer, and overexpression of TRIM29 mRNA is associated with poor prognosis and lower survival. However, most of the mechanisms of TRIM29 in gastric cancer are still unclear. RNA interference technique is a highly specific and easy-to-operate gene RNA transcription blocking technique found in recent years. In this study, we tried to detect the expression of TRIM29 gene and protein in gastric cancer tissues by using Real time qRT-PCR, Western-blot and siRNA interference technique, thus providing the basis for explaining the relationship between TRIM29 expression and clinical and prognosis in patients with gastric cancer. Purpose 1. To investigate the relationship between expression of TRIM29 and clinical and prognosis of gastric cancer patients. The effect mechanism of TRIM29 on gastric cancer cells was analyzed by transfection of siRNA plasmid and inhibition of the cells expressing TRIM29. In the nude mouse experiment, the effect of the expression level of TRIM29 on gastric cancer cells was studied by analyzing the tumorigenesis of TRIM29 cells. Method 1. 38 cases of gastric adenocarcinoma treated in our hospital from March 2010 to January 2015 were collected, divided into neoadjuvant chemotherapy group (16 cases) and direct operation group (22 cases). To compare the expression of 1nRNA and the protein level of TRIM29 in the above specimens, the reason was analyzed. The expression levels of TRIM29 mRNA and protein were detected in different gastric cancer cell lines. After transfection of siRNA plasmids, the expression levels of TRIM29, P53 and B-catenin were detected by Real time qRT-PCR and Western blot. The cell doubling time was detected by MTT method and the growth curve was drawn. Flow cytometry was used to analyze the distribution of cell cycle before and after interference. TRIM29 overexpressing gastric cancer cells were selected, siRNA plasmid was transfected, transplanted in nude mice, the size and growth of transplanted tumor were observed, and the expression level of TRIM29 was detected. Result 1. The results of Real-time qRT-PCR and Western-blot showed that the expression of TRIM29 mRNA and protein in the positive lymph node specimen was significantly higher than that of normal gastric mucosa and negative lymph node (P <0.001). In both the direct surgical group and the neoadjuvant chemotherapy group, the mean survival time of TRIM29 expression-positive patients was significantly lower than that of patients with negative expression of TRIM29 (Log-systemx2 = 4.068; P = 0. 034; Log-systemx2 = 7. 487; P = 0. 006). The expression level of mRNA after neoadjuvant chemotherapy in TRIM29 patients was significantly lower than that before chemotherapy. The levels of nRNA and protein in TRIM29 in different gastric cancer cell lines were increased. The expression of p53 was down-regulated in different gastric cancer cell lines with positive expression of TRIM29, while B-catenin showed abnormally high expression. After RNA interference, the expression level of TRIM29mRNA and protein in gastric cancer cell line transfected with siRNA plasmid was decreased, which was significantly lower than that of transfected blank plasmid. The expression level of p53 mRNA and its protein was significantly higher than that before RNA interference, and the expression level of B-catenin mRNA and its protein was significantly lower than that before RNA interference. Compared with RNA interference, the proliferation ability of gastric cancer cell line induced by TRIM29 was significantly decreased after RNA interference. The expression of TRIM29 before transfection of siRNA plasmid showed metastatic tumor within 60 days under the subcutaneous growth of 5 nude mice, and the tumor diameter was 0.4 ~ 1. 9cm. After the siRNA plasmid was transfected, the expression of TRIM29 showed solid tumors in 4 nude mice, and the diameter was 0. 1-0. 5cm (P0.05). The expression of TRIM29mRNA and protein level before siRNA plasmid transfection was significantly higher than that of siRNA plasmid. Conclusion 1. TRIM29 mRNA and protein expression increased significantly in patients with gastric cancer, and the survival time of TRIM29 positive patients was shorter and the prognosis was worse. Neoadjuvant chemotherapy can affect the expression level of TRIM29 to some extent. The ability of TRIM29 to promote the proliferation of gastric cancer cells was further demonstrated by experiments in nude mice.
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.2

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本文編號(hào)：2291009