【摘要】：研究目的胃癌是我國(guó)現(xiàn)階段最常見的消化道惡性腫瘤,存在早期診斷率較低,易發(fā)生局部和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,患者生存期短、預(yù)后差及生存質(zhì)量不佳。胃癌發(fā)生常與腫瘤相關(guān)基因結(jié)構(gòu)改變與表達(dá)異常有關(guān),研究與腫瘤發(fā)生相關(guān)的關(guān)鍵基因,對(duì)于研制針對(duì)胃癌的靶向藥物意義重大。幽門螺桿菌(Helicobacter pylori, H pylori)感染與胃癌的發(fā)生密切相關(guān),為類致癌原,系統(tǒng)規(guī)范根除幽門螺桿菌可明顯降低胃癌的發(fā)病率。幽門螺桿菌導(dǎo)致胃癌發(fā)生的具體機(jī)制,尤其是幽門螺桿菌與癌基因及抑癌基因的關(guān)系,一直是近年來的研究熱點(diǎn),明確其致癌機(jī)制可為胃癌的預(yù)防和治療提供重要依據(jù)。DBC2(deletion in breast cancer 2)是最初在乳腺癌研究中發(fā)現(xiàn)的一種抑癌基因,其表達(dá)缺失被證實(shí)與乳腺癌、膀胱癌、肺癌等多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。DBC2能夠參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中及蛋白降解中起著關(guān)鍵作用。DBC2還能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡。因此,在腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及侵襲轉(zhuǎn)移過程中DBC2可能發(fā)揮著重要作用。胃癌的發(fā)生與細(xì)胞凋亡-增殖平衡的失調(diào)有關(guān),表現(xiàn)為增殖過度,而凋亡減少。凋亡是機(jī)體清除病理狀態(tài)下增生的腫瘤細(xì)胞的重要途徑之一,凋亡調(diào)控基因的異常表達(dá)會(huì)促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。癌基因、抑癌基因通過不同形式發(fā)揮各自的功能效應(yīng),但最終都會(huì)影響細(xì)胞周期,結(jié)果是正常細(xì)胞表現(xiàn)為失控性生長(zhǎng),導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生。胃癌的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移不僅與癌細(xì)胞自身的生物學(xué)特性有關(guān),而且也是腫瘤細(xì)胞和組織微環(huán)境相互作用的結(jié)果,其過程涉及粘附、趨化等多種作用機(jī)制。趨化因子受體CXCR4是一種組織表達(dá)廣泛的細(xì)胞因子受體,與胃癌等多種惡性腫瘤的生長(zhǎng)和侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。憑借趨化因子受體與其配體的特異性結(jié)合力,腫瘤細(xì)胞最終實(shí)現(xiàn)了向原發(fā)灶之外的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。探尋與胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)的功能基因,進(jìn)而獲得預(yù)示腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)志物和對(duì)轉(zhuǎn)移性胃癌靶向治療的措施是最終研究目標(biāo)。因此,研究抑癌基因?qū)ξ赴┣忠u轉(zhuǎn)移的影響很有必要。盡管DBC2作為抑癌基因與腫瘤相關(guān)性的研究很多,但DBC2在幽門螺桿菌相關(guān)胃癌發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中的作用尚不十分明確,DBC2能否發(fā)揮抑制胃癌的作用?DBC2的表達(dá)與幽門螺桿菌感染、胃癌的發(fā)生、侵襲轉(zhuǎn)移及臨床病理之間的關(guān)系如何?如果DBC2能夠抑制胃癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展,那么DBC2是通過何種機(jī)制影響胃癌細(xì)胞的生物學(xué)特性的?這些都是我們本課題研究的目的。目的：1.本研究以正常胃黏膜細(xì)胞株、胃癌細(xì)胞株及人體胃癌組織標(biāo)本為實(shí)驗(yàn)材料,從蛋白及核酸水平檢測(cè)DBC2基因的表達(dá),并比較不同組群之間的差異,分析DBC2的表達(dá)缺失與幽門螺桿菌感染相關(guān)胃癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性。2.以有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移背景的胃腺癌細(xì)胞株SGC7901為研究對(duì)象,利用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建DBC2過表達(dá)載體,對(duì)DBC2基因在mRNA及蛋白水平表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。3.研究DBC2的表達(dá)對(duì)感染幽門螺桿菌的胃癌細(xì)胞SGC7901的增殖、凋亡和細(xì)胞周期等方面的影響,探討DBC2在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。4.研究DBC2對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響。研究方法1.利用免疫組織化學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)不同人體組織標(biāo)本及細(xì)胞標(biāo)本中DBC2的表達(dá)情況。2.采用RT-PCR方法檢測(cè)DBC2mRNA的表達(dá)情況,并分析與幽門螺桿菌感染、臨床病理特征的關(guān)系。3.利用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù),設(shè)計(jì)DBC2過表達(dá)載體。4.轉(zhuǎn)染幽門螺桿菌干預(yù)的胃癌SGC7901細(xì)胞后,利用RT-PCR法和Western Blot法檢測(cè)DBC2mRNA和蛋白的表達(dá)情況。5.利用MTT法、流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后感染幽門螺桿菌的SGC7901細(xì)胞的增殖、凋亡、細(xì)胞周期情況。6.免疫組織化學(xué)法和Western Blot法檢測(cè)SGC7901細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后caspase-3蛋白的表達(dá)情況。7. Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SGC7901細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后的轉(zhuǎn)移、侵襲能力。8. Western Blot法檢測(cè)SGC7901細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后CXCR4的表達(dá)情況。結(jié)果1. 在感染幽門螺桿菌的相對(duì)正常或炎癥組織中,DBC2表現(xiàn)為較高水平的表達(dá)。而在胃癌組織中,DBC2則主要呈低表達(dá)或無表達(dá)(P0.05)。在24h和48h檢測(cè)發(fā)現(xiàn),DBC2在GES-1-Hp細(xì)胞爬片中呈較高水平陽(yáng)性表達(dá),而在SGC7901-Hp組中DBC2則表現(xiàn)為低表達(dá)或缺失表達(dá),兩者差異明顯(P0.05)。同時(shí)還發(fā)現(xiàn),在感染Hp的24h和48小時(shí)兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的同組細(xì)胞爬片間,DBC2的表達(dá)無明顯差異。2. DBC2 mRNA在感染Hp的GES-1細(xì)胞中在24h和48h均呈高擴(kuò)增狀態(tài),表現(xiàn)為高表達(dá),而在感染Hp的SGC7901細(xì)胞中DBC2 mRNA擴(kuò)增倍數(shù)較低,呈極低水平表達(dá),兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.與浸潤(rùn)深度為T1、T2的胃癌組織相比,浸潤(rùn)深度為T3、T4的胃癌組織具有更明顯的DBC2的表達(dá)缺失,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與Ⅰ、Ⅱ期胃癌組織相比,Ⅲ、Ⅳ期胃癌組織的DBC2的表達(dá)缺失明顯(P0.05)。而且,DBC2的缺失表達(dá)與腫瘤分化程度密切相關(guān),腫瘤分化程度越低,DBC2缺失表達(dá)更明顯。同時(shí)發(fā)現(xiàn),DBC2的表達(dá)缺失與胃癌患者的性別、發(fā)病年齡、及腫瘤Borrmann分型和大小無明顯相關(guān)性(P0.05)。4.與GES-1細(xì)胞相比較,SGC7901細(xì)胞的DBC2mRNA的表達(dá)水平是明顯降低的,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與SGC7901空載體組相比,而轉(zhuǎn)染的SGC7901細(xì)胞在轉(zhuǎn)染24h后的DBC2mRNA表達(dá)水平即明顯升高,兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。并且轉(zhuǎn)染48h后SGC7901細(xì)胞內(nèi)的DBC2mRNA擴(kuò)增水平進(jìn)一步升高,高于GES-1細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)增倍數(shù),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。5. 用DBC2/GAPDH吸光度比值代表DBC2蛋白表達(dá)水平,以SGC7901-DBC2轉(zhuǎn)染組最高。GES-1組及SGC7901-DBC2轉(zhuǎn)染組內(nèi)的目的基因DBC2蛋白呈明顯較高水平表達(dá),而SGC7901空載體轉(zhuǎn)染組內(nèi)DBC2蛋白呈極低水平表達(dá),前兩者與后者相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),說明外源性DBC2在胃癌細(xì)胞系SGC7901中得到了較穩(wěn)定表達(dá)。6. 與GES-1細(xì)胞相比,SGC7901細(xì)胞的增殖活力明顯增強(qiáng)(P0.05)。與轉(zhuǎn)染空載體的SGC7901組相比,轉(zhuǎn)染DBC2組的細(xì)胞自第二日開始增殖減慢,時(shí)間越長(zhǎng),兩者表現(xiàn)的差異更為顯著(P0.05)。7. 與未轉(zhuǎn)染的SGC7901細(xì)胞相比,DBC2轉(zhuǎn)染組細(xì)胞周期中S期的比例升高,同時(shí)伴隨G2期和G1期比例的下降。說明DBC2對(duì)胃癌細(xì)胞SGC7901的生長(zhǎng)抑制調(diào)節(jié)是通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期S期(DNA復(fù)制期)阻滯,以阻止細(xì)胞進(jìn)入G2期而實(shí)現(xiàn)的。8.24h與GES-1細(xì)胞(3.55%±0.73%)及SGC7901空載體細(xì)胞組(6.17%±1.85%)相比,轉(zhuǎn)染DBC2的SGC7901細(xì)胞組凋亡率(12.37%±1.67%)均明顯升高(P0.05)。48h后與GES-1細(xì)胞(3.50%±0.89%)及SGC7901空載體細(xì)胞組(6.18%±1.97%)相比,轉(zhuǎn)染DBC2的SGC7901細(xì)胞組凋亡率(16.84%±3.62%)均明顯升高(P0.05)9.與陰性對(duì)照組(終評(píng)分2.18±0.06)和空載體組(終評(píng)分2.21±0.11)相比,轉(zhuǎn)染DBC2的SGC7901細(xì)胞的SGC7901-DBC2轉(zhuǎn)染組caspase3活化(終評(píng)分9.87±1.65)明顯,表達(dá)率明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。10.與SGC7901細(xì)胞陰性對(duì)照組(0.46±0.04)相比,SGC7901-DBC2轉(zhuǎn)染組(0.63±0.08)的caspase3蛋白活化表達(dá)水平明顯升高,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。11.在24h這一時(shí)間點(diǎn),正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1的遷移能力是極低的,與胃癌SGC7901-空載體組及SGC7901-DBC2轉(zhuǎn)染組穿膜細(xì)胞數(shù)相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。同時(shí)發(fā)現(xiàn),與SGC7901-空載體組相比,SGC7901-DBC2轉(zhuǎn)染組的穿膜細(xì)胞數(shù)明顯降低(P0.05)。在48h時(shí),SGC7901-DBC2轉(zhuǎn)染組的穿膜細(xì)胞數(shù)仍相對(duì)明顯降低,與SGC7901-空載體組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。12.在24h,與GES-1細(xì)胞相比,胃癌SGC7901-空載體組及SGC7901-DBC2轉(zhuǎn)染組侵襲穿膜細(xì)胞數(shù)相比明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特征相一致。同時(shí),相比SGC7901-空載體組穿膜細(xì)胞數(shù),SGC7901-DBC2轉(zhuǎn)染組明顯降低(P0.05)。而在48h時(shí),SGC7901-DBC2轉(zhuǎn)染組穿膜細(xì)胞數(shù)降低更為明顯,相比SGC7901-空載體組而言,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。13.與SGC7901細(xì)胞空白對(duì)照組(0.15±0.01)和SGC7901-空載體組相比(0.16±0.01), SGC7901-DBC2轉(zhuǎn)染組(0.08±0.01)的CXCR4蛋白的表達(dá)水平明顯降低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論1.正常胃組織及胃黏膜上皮細(xì)胞中,DBC2呈高表達(dá)狀態(tài)。DBC2在幽門螺桿菌相關(guān)胃癌組織及胃癌細(xì)胞中在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)水平均呈表達(dá)高頻缺失,而且DBC2的表達(dá)缺失水平與腫瘤臨床分期、浸潤(rùn)深度以及分化程度密切相關(guān)。2.我們成功完成了針對(duì)胃癌SGC7901細(xì)胞的DBC2重組過表達(dá)載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)染。應(yīng)用RT-PCR及Western-blot技術(shù)從轉(zhuǎn)錄和蛋白水平檢測(cè)了感染幽門螺桿菌的SGC7901細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后DBC2的表達(dá)差異。與對(duì)照組相比,轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中的DBC2水平明顯升高。3.DBC2具有能夠抑制幽門螺桿菌相關(guān)胃癌細(xì)胞增殖活力的能力,影響細(xì)胞周期,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡,從而實(shí)現(xiàn)抑癌作用。凋亡的調(diào)控可能是通過影響caspase-3表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。DBC2可能通過增強(qiáng)細(xì)胞中caspase-3舌化表達(dá)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡,進(jìn)而起到抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用。4.DBC2能夠抑制幽門螺桿菌相關(guān)胃癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力,并且能抑制趨化因子受體CXCR4的表達(dá)。DBC2可能通過抑制CXCR4的表達(dá)這一途徑而抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的。創(chuàng)新性及意義1. 目前有關(guān)DBC2作為抑癌基因與幽門螺桿菌相關(guān)胃癌關(guān)系的研究鮮有報(bào)道,本研究首次檢測(cè)了DBC2在幽門螺桿菌相關(guān)胃癌中的表達(dá)缺失情況及與臨床病理特征之間的關(guān)系。2. 首次相對(duì)較全面研究了DBC2干預(yù)下對(duì)于感染幽門螺桿菌的胃癌SGC7901細(xì)胞的增殖、凋亡及細(xì)胞周期等生物學(xué)特性的影響。3.對(duì)于將來臨床上分子靶向治療幽門螺桿菌相關(guān)胃癌奠定了理論基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.2
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本文編號(hào)：2289030