發(fā)布時(shí)間：2018-10-22 19:46

【摘要】：背景肺癌(Lung cancer)在我國(guó)及世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率和死亡率均居惡性腫瘤之首。據(jù)2014年世界衛(wèi)生組織所發(fā)報(bào)告顯示,每年約180萬(wàn)新發(fā)病例；五年生存率僅為15%,2012年全球肺癌死亡病例約160萬(wàn)例,并且男性和女性肺癌死亡的病人分別約占全球癌癥死亡總?cè)藬?shù)的24%和14%。在我國(guó),每年肺癌新發(fā)病例為67.6萬(wàn),死亡病例56.5萬(wàn)。非小細(xì)胞肺癌在肺癌中占較大多數(shù),但許多非小細(xì)胞肺癌患者在診斷時(shí)已屬晚期,喪失了手術(shù)機(jī)會(huì),多模式的化療成為非小細(xì)胞肺癌晚期重要的治療手段。以順鉑為基礎(chǔ)的聯(lián)合治療已成為非小細(xì)胞肺癌的一線化療方案,然而順鉑的耐藥性問(wèn)題越來(lái)越突出,制約了抗腫瘤藥物療效的發(fā)揮,導(dǎo)致化療的失敗。探索非小細(xì)胞肺癌順鉑耐藥的發(fā)生機(jī)制,是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。CXCR4是G蛋白耦聯(lián)的七次跨膜受體,具有高度的保守性。其編碼基因位于染色體2q21,共有352個(gè)氨基酸組成。其胞外N端區(qū)與配體結(jié)合,胞內(nèi)區(qū)則與G蛋白偶聯(lián),C端含絲氨酸/蘇氨酸可磷酸化。通過(guò)參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在胚胎發(fā)育、炎癥及免疫反應(yīng)、血管生成、造血調(diào)控等方面發(fā)揮重要作用。自2001年Muller首先報(bào)道CXCR4在乳腺癌組織中高表達(dá)以來(lái),研究發(fā)現(xiàn)CXCR4在胰腺癌、乳腺癌、膀胱癌,前列腺癌和卵巢癌等多種腫瘤細(xì)胞普遍表達(dá),在增長(zhǎng)、遷移、侵襲過(guò)程中具有重要作用,通過(guò)與相對(duì)應(yīng)的特異性配體(CXCL12)結(jié)合,產(chǎn)生靶器官的特異性轉(zhuǎn)移。我們前期研究發(fā)現(xiàn)趨化因子受體4(CXCR4)在肺癌組織中高表達(dá),并參與了肺癌的增殖和侵襲,導(dǎo)致腫瘤的轉(zhuǎn)移。也有研究發(fā)現(xiàn)CXCR4的表達(dá)與部分腫瘤的耐藥相關(guān)。Hope等報(bào)道急性髓細(xì)胞性白血病通過(guò)高表達(dá)CXCR4進(jìn)而促進(jìn)G0期的急性髓細(xì)胞性白血病細(xì)胞亞群集聚在基質(zhì)層。而處于G0期的急性髓細(xì)胞性白血病細(xì)胞對(duì)化療藥物不敏感,進(jìn)而產(chǎn)生耐藥。Li J等通過(guò)采用免疫組化方法發(fā)現(xiàn)CXCR4在上皮性卵巢癌的表達(dá)與順鉑耐藥呈正相關(guān),而通過(guò)RNA干擾技術(shù)降低上皮性卵巢癌細(xì)胞中CXCR4表達(dá)可逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥的發(fā)生。但CXCR4是否參與肺癌順鉑耐藥的產(chǎn)生及相應(yīng)機(jī)制有待深入的研究。第一部分CXCR4表達(dá)與肺癌順鉑耐藥相關(guān)性的研究目的 比較CXCR4在肺癌順鉑耐藥組和敏感組的表達(dá)差異；比較CXCR4在肺癌A549順鉑耐藥細(xì)胞株(A549/DDP)及其親本細(xì)胞(A549)表達(dá)的差異。方法收集武漢大學(xué)人民醫(yī)院胸外科于2012年5月至2015年10月行手術(shù)切除的64例非小細(xì)胞肺癌患者的病理標(biāo)本及臨床資料,并進(jìn)行隨訪。如無(wú)病生存時(shí)間小于12個(gè)月(包括12個(gè)月)被認(rèn)為對(duì)鉑類耐藥,無(wú)病生存時(shí)間超過(guò)12個(gè)月者被認(rèn)為是對(duì)鉑類敏感。運(yùn)用免疫組織化學(xué)法分析CXCR4在64例非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)：采用RT-PCR、Western-blot和免疫熒光實(shí)驗(yàn)分析CXCR4在肺癌A549順鉑耐藥細(xì)胞株(A549/DDP)及其親本細(xì)胞(A549)表達(dá)。結(jié)果本組獲得隨訪的共有64例患者,共有32例患者被認(rèn)定為順鉑耐藥,即耐藥組32例,敏感組32例。在檢測(cè)的32例順鉑敏感的肺癌組織標(biāo)本中,CXCR4的陰性表達(dá)率為40.6%,低表達(dá)28.1%,中等表達(dá)18.8%,高表達(dá)12.5%;而檢測(cè)的32例順鉑耐藥的肺癌組織中,CXCR4的陰性表達(dá)15.6%,低表達(dá)34.4%,中等表達(dá)21.9%,高表達(dá)28.1%,兩者之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);耐藥組的染色評(píng)分1.63±1.07(而敏感組1.03±1.06),兩者之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P.001)。RT-PCR、Western-blot和免疫熒光實(shí)驗(yàn)分析等實(shí)驗(yàn)證實(shí)CXCR4在肺癌A549順鉑耐藥細(xì)胞株(A549/DDP)表達(dá)明顯高于其親本細(xì)胞(A549)的表達(dá),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。結(jié)論CXCR4在順鉑耐藥的肺癌組織及細(xì)胞中高表達(dá),可能具有潛在的促進(jìn)肺癌順鉑耐藥作用。第二部分CXCR4對(duì)非小細(xì)胞肺癌耐藥性影響的研究目的擬通過(guò)RNA干擾技術(shù)觀察降低CXCR4的表達(dá)對(duì)肺癌細(xì)胞順鉑耐藥的影響,進(jìn)一步探討CXCR4在肺癌順鉑耐藥中的作用。方法通過(guò)構(gòu)建靶向CXCR4的RNA干擾質(zhì)粒,并通過(guò)脂質(zhì)體系統(tǒng)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入人肺癌順鉑耐藥細(xì)胞株A549/DDP及其親本細(xì)胞株A549；應(yīng)用RT-PCR和Western blot分別檢測(cè)CXCR4 mRNA和蛋白表達(dá)水平；利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)；Western blot檢測(cè)順鉑作用對(duì)人肺癌A549細(xì)胞和A549-DDP細(xì)胞CXCR4蛋白的影響；CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖；MTT法檢測(cè)RNA干擾技術(shù)沉默CXCR4表達(dá)對(duì)順鉑耐藥性的影響。結(jié)果成功構(gòu)建CXCR4干擾質(zhì)粒;siRNA沉默CXCR4的表達(dá)后,CXCR4在mRNA和蛋白表達(dá)水平受到明顯抑制。CCK-8法結(jié)果顯示si-CXCR4 A549和si-CXCR4 A549/DDP組細(xì)胞的受到抑制,并在培養(yǎng)的第48h和72h其增殖能力顯著低于si-NC A549和si-NC A549/DDP組；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CXCR4基因表達(dá)抑制后對(duì)A549、A549/DDP細(xì)胞凋亡的影響,與空載體對(duì)照組(11.16%和4.93%)相比,si-CXCR4 A549和si-CXCR4 A549/DDP結(jié)果顯示兩組組細(xì)胞的凋亡率分別為20.62%和6.64%%；MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示抑制CXCR4基因表達(dá)后,與對(duì)照組A549/DDP相比,順鉑對(duì)si-CXCR4 A549/DDP細(xì)胞半數(shù)抑制濃度(IC50)明顯下降(14.837±0.099 μ g/m1和9.969±0.318μ g/m1),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：通過(guò)RNA干擾技術(shù)沉默CXCR4的表達(dá)可降低肺癌細(xì)胞順鉑耐藥的現(xiàn)象,進(jìn)一步證實(shí)CXCR4參與了肺癌的順鉑耐藥。第三部分CXCR4通過(guò)CYP1B1調(diào)控肺癌細(xì)胞的耐藥性目的我們?cè)谇捌诘难芯恐邪l(fā)現(xiàn)肺癌順鉑耐藥與肺癌細(xì)胞的CXCR4的表達(dá)呈正相關(guān),而沉默CXCR4的表達(dá)可以降低A549順鉑耐藥細(xì)胞株的耐藥性,提示CXCR4與肺癌順鉑耐藥有著密切的關(guān)系。但CXCR4介導(dǎo)肺癌順鉑耐藥的作用機(jī)制不明晰。方法本研究通過(guò)生物信息學(xué)篩選分析數(shù)據(jù)集GSE42568中293例和數(shù)據(jù)集GSE41271中275例肺癌組織的基因組表達(dá)數(shù)據(jù),尋找能與CXCR4相互作用的蛋白介導(dǎo)順鉑耐藥；并通過(guò)免疫組化檢測(cè)二者在病理標(biāo)本表達(dá)情況;western-blot檢測(cè)分析siRNA CXCR4轉(zhuǎn)染前后的肺癌A549/DDP細(xì)胞株的CYP1B1蛋白的表達(dá)情況。siRNA干擾CYP1B1的表達(dá),并通過(guò)RT-PCR和Western blot分別檢測(cè)CYP1B1在mRNA和蛋白表達(dá)水平；MTT法檢測(cè)RNA干擾技術(shù)沉默CYP1B1表達(dá)對(duì)順鉑耐藥性的影響；流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)。結(jié)果通過(guò)生物信息學(xué)方法得出CXCR4和CYP1B1參與肺癌耐藥；免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CYP1B1在順鉑耐藥組肺癌組織中表達(dá)明顯高于順鉑敏感肺癌組織；采用Pearson相關(guān)分析方法分析CXCR4與CYP1B1在順鉑耐藥及敏感兩組肺癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)；western-blot檢測(cè)分析siRNA轉(zhuǎn)染前后的肺癌A549/DDP細(xì)胞株的CYP1B1蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示與轉(zhuǎn)染空白載體的細(xì)胞相比,發(fā)現(xiàn)肺癌A549/DDP細(xì)胞株經(jīng)si-CYP1B1轉(zhuǎn)染后CYP1B1蛋白表達(dá)水平均明顯降低。RNA干擾CXCR4表達(dá)后,Western blot結(jié)果顯示CYP1B1在si-CXCR4 A549/DDP組細(xì)胞的表達(dá)受到抑制,顯著低于si-NC A549/DDP組。siRNA下調(diào)CYP1B1的表達(dá)后,CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示與si-RNA NC對(duì)照組細(xì)胞相比,在順鉑作用下si-CYP1B1組細(xì)胞活性明顯降低；與空載體對(duì)照組(2.0%和0.7%)相比,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果提示si-CYP1B1 A549和si-CYP1B1 A549/DDP兩組組細(xì)胞的凋亡率分別為7.5%和2.0%,凋亡有明顯增加。結(jié)論：CXCR4通過(guò)調(diào)控CYP1B1的表達(dá)參與肺癌順鉑耐藥的形成過(guò)程。
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【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R734.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2288130