【摘要】：研究背景與目的肺癌是全世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤,其五年生存率僅為15.9%。在肺癌的所有組織學(xué)分型當(dāng)中,腺癌已經(jīng)成為一種最常見的組織學(xué)類型。由于健康查體并未完全普及,對于大多數(shù)患者而言,當(dāng)被確診患有肺惡性腫瘤時(shí),根據(jù)UICC癌癥TNM分期,腫瘤已處于中晚期。對于ⅢA期非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)患者,因?yàn)橥饪漆t(yī)生無法完全切除所有可能存在轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)組織,所以單純進(jìn)行手術(shù)治療的療效并不令人滿意。根據(jù)NCCN指南,對于ⅢA期NSCLC患者,應(yīng)在手術(shù)前先進(jìn)行兩個(gè)周期的新輔助化療,只有當(dāng)腫瘤明顯縮小且腫瘤對側(cè)縱膈淋巴結(jié)完全消失,手術(shù)才能作為后續(xù)的治療手段。因此,新輔助化療作為針對中晚期肺癌患者的例行治療手段,在世界范圍內(nèi)被廣泛認(rèn)可。其中,鉑類聯(lián)合培美曲塞是針對肺腺癌的一線新輔助化療方案。然而,當(dāng)新輔助化療兩個(gè)周期后,復(fù)查CT評估化療療效時(shí)發(fā)現(xiàn),只有少部分肺腺癌患者可以取得理想的治療效果。由于腫瘤的耐藥性及異質(zhì)性,順鉑聯(lián)合培美曲塞化療方案所取得的療效具有顯著的個(gè)體差異。臨床急需探尋肺腺癌的高效治療手段,隨著對腫瘤研究的不斷深入,對于中晚期NSCLC的一線治療方案正在由傳統(tǒng)化療逐漸轉(zhuǎn)化為更具個(gè)體化的基因治療。目前用于預(yù)測NSCLC的發(fā)生發(fā)展,以及對于藥物耐藥性的分子標(biāo)記物研究已經(jīng)取得了重大進(jìn)展。分子標(biāo)記物可以區(qū)分非小細(xì)胞肺癌患者對于某類藥物的化療敏感性,從而為患者選擇最優(yōu)治療方案。DNA的內(nèi)源性及外源性損傷在肺腺癌的發(fā)生和發(fā)展中起至關(guān)重要的作用。在所有的DNA損傷類型當(dāng)中,DNA雙鏈斷裂(DNAdouble-strand breaks, DSBs)是最為嚴(yán)重、最為危險(xiǎn)的,且未修復(fù)的DSBs會(huì)導(dǎo)致基因的不穩(wěn)定以及腫瘤的發(fā)生。對于DSBs的修復(fù)主要通過DNA非同源末端連接(nonhomologous end joining,NHEJ)和 DNA 同源重組(homologous recombination, HR)兩種方式。NHEJ 修復(fù)機(jī)制在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中起主要作用,該修復(fù)機(jī)制是由DNA蛋白激酶催化亞基(catalytic subunit of DNA protein kinase,DNA-PKcs )、Ku 蛋白、X 射線修復(fù)交叉互補(bǔ)蛋白 4 (X-ray cross complementing 4,XRCC4)以及 DNA 連接酶Ⅳ等一系列催化亞基共同作用完成的。異質(zhì)二聚體Ku抗原作為DSBs的分子探測器,由分子量為70kDA (Ku70)和80kDA (Ku80)兩個(gè)亞基組成,且Ku蛋白可以直接結(jié)合DNA末端來激活DNA-PK。Gu et al報(bào)道稱當(dāng)細(xì)胞抑制DNA-PK或者Ku80表達(dá),DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)就無法繼續(xù)進(jìn)行修復(fù)工作。Ma et al指出Ku80蛋白可以降低鉑類藥物對于肺腺癌細(xì)胞的損傷,敲除Ku80基因可以提高肺腺癌細(xì)胞的放療及化療敏感性。然而,絕大多數(shù)研究取材于手術(shù)后患者的腫瘤標(biāo)本進(jìn)行分析,而在肺腺癌患者新輔助化療開始之前,Ku80是否能夠預(yù)測順鉑、培美曲塞聯(lián)合化療的化療敏感性,至今未知。本研究通過在基因以及蛋白水平上檢測ⅢA期肺腺癌患者組織中Ku80的表達(dá)情況,探索并確定肺腺癌中Ku80表達(dá)水平與患者臨床特征以及新輔助化療療效的相關(guān)性。體外實(shí)驗(yàn)中,分別用短發(fā)卡RNA(small hairpin RNA,shRNA)和互補(bǔ)DNA (complementary DNA, cDNA)來抑制和上調(diào)Ku80的表達(dá),探索Ku80的表達(dá)情況對順鉑、培美曲塞聯(lián)合介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響。本研究旨在探討Ku80是否能夠預(yù)測ⅢA期肺腺癌患者接受順鉑、培美曲塞聯(lián)合化療的敏感性,從而為ⅢA期肺腺癌的治療提供新的思路。第一部分Ku80在肺腺癌組織的表達(dá)以及臨床意義目的1.檢測Ku80在肺腺癌組織的表達(dá)情況2.分析肺腺癌組織Ku80表達(dá)水平的高低與臨床病理特征以及新輔助化療療效的相關(guān)性方法1.對2013年9月到2016年9月所有在山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院胸外科就診的肺癌患者進(jìn)行支氣管鏡檢查,病理學(xué)證實(shí)為肺腺癌且臨床分期為ⅢA期的110名患者入選本課題。沒有患者接受過化療、放療以及靶向治療。所有病人都接受相同的一線新輔助化療方案兩個(gè)周期(順鉑聯(lián)合培美曲塞),通過CT評估患者的療效。2.所有腫瘤標(biāo)本均來自于支氣管鏡活檢,運(yùn)用免疫組化和實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)來檢測110位肺腺癌患者組織中Ku80mRNA和蛋白的表達(dá)水平。結(jié)合患者臨床資料以及患者的化療療效,應(yīng)用SPSS19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,采用X2檢驗(yàn)探討Ku80表達(dá)水平的高低與患者臨床病理特征的關(guān)系以及Ku80表達(dá)情況對于患者化療敏感性的影響。結(jié)果110位ⅢA期肺腺癌患者根據(jù)化療療效,38人判定為化療有效(34.5%),72人判定為化療無效(65.5%)。38位化療有效患者的肺腺癌組織中Ku80 mRNA相對表達(dá)水平顯著低于72位化療無效患者的肺癌組織(3.612±2.392,7.981±2.684;p0.05)。化療有效組的肺腺癌組織中Ku80免疫組化評分也顯著低于化療無效組(2,079±1.617, 5.597±2.114;p0.05)。卡方檢驗(yàn)顯示 Ku80mRNA 以及蛋白水平的表達(dá)與患者的腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及化療敏感性相關(guān)(p0.05),而與患者的年齡、性別以及吸煙情況無明顯相關(guān)性。結(jié)論1.同化療療效較好的患者相比,療效差的患者Ku80在肺癌組織中表達(dá)顯著增高。2.肺腺癌患者的惡性臨床病理特征與Ku80在mRNA和蛋白水平的表達(dá)情況密切相關(guān)。第二部分靶向抑制或上調(diào)肺腺癌細(xì)胞Ku80的表達(dá)水平對細(xì)胞生物學(xué)行為以及對于順鉑聯(lián)合培美曲塞化療敏感性的影響目的1.探索Ku80基因?qū)τ诜蜗侔〢549細(xì)胞系生物學(xué)功能的影響。2.明確特異性沉默以及上調(diào)肺腺癌細(xì)胞Ku80的表達(dá)對于體外順鉑聯(lián)合培美曲塞化療敏感性的影響方法1.構(gòu)建靶向沉默Ku80 shRNA和過表達(dá)Ku80 cDNA慢病毒載體,并轉(zhuǎn)染肺腺癌細(xì)胞得到Ku80沉默A549細(xì)胞系以及Ku80過表達(dá)A549細(xì)胞系。運(yùn)用qRT-PCR以及Western blot方法檢測Ku80基因沉默及過表達(dá)效果。2. CCK8檢測轉(zhuǎn)染與未轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞的增殖能力,繪制細(xì)胞生長曲線。按梯度配置聯(lián)合化療藥物細(xì)胞培養(yǎng)基,應(yīng)用CCK-8檢測聯(lián)合化療藥物對于轉(zhuǎn)染及未轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞活性的影響。運(yùn)用Transwell實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)測定抑制或者上調(diào)Ku80的表達(dá)水平對于A549細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。流式細(xì)胞術(shù)探索轉(zhuǎn)染前后A549細(xì)胞對于同一濃度聯(lián)合化療藥物所致凋亡比率的差異。結(jié)果1.選擇3個(gè)最佳siRNA序列,由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司構(gòu)建包含相應(yīng)shRNA的相應(yīng)GV115慢病毒載體:shRNA86、shRNA87、shRNA89,同時(shí)根據(jù)scramble序列,構(gòu)建相應(yīng)慢病毒載體作為陰性對照。shRNA以及scramble序列轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后,細(xì)胞狀態(tài)良好,轉(zhuǎn)染率超過80%。2.由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司制備Ku80過表達(dá)cDNA介導(dǎo)的慢病毒載體以及其相應(yīng)的空病毒作為陰性對照。Ku80-cDNA及相應(yīng)對照病毒載體轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后,細(xì)胞狀態(tài)較好,轉(zhuǎn)染率大于80%。3.qRT-PCR檢測結(jié)果表明:正常A549細(xì)胞Ku80mRNA相對表達(dá)量為1,感染shRNA-scramble、shRNA86、shRNA87 以及 shRNA89 的 A549 細(xì)胞 Ku80 mRNA的相對表達(dá)量為 1.083±0.15、0.534±0.17、0.663±0.13 以及 0.916±0.11。感染空病毒以及Ku80-cDNA的A549細(xì)胞Ku80 mRNA相對表達(dá)量為1.051±0.112、2.231±0.194。其中,在下調(diào)Ku80基因表達(dá)的shRNA序列中,shRNA86轉(zhuǎn)染后A549細(xì)胞的Ku80mRNA相對表達(dá)量最低,相對于其陰性對照組差異顯著(p0.05)。Ku80-cDNA轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞Ku80 mRNA的相對表達(dá)量明顯高于其陰性對照組及正常未進(jìn)行轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞,說明Ku80-cDNA可以顯著增加A549細(xì)胞的Ku80 mRNA表達(dá)。4.Western blot檢測慢病毒轉(zhuǎn)染效率:正常A549細(xì)胞Ku80蛋白的相對表達(dá)量為1,感染 ShRNA-scramble、shRNA86、shRNA87 以及 shRNA89 的 A549 細(xì)胞 Ku80蛋白的相對表達(dá)量為 0.892±0.15、0.033±0.029、0.072±0.009 以及 0.530±0.061。感染空病毒以及Ku80-cDNA的A549細(xì)胞Ku80蛋白的相對表達(dá)量為1.083±0.182、2.102±0.574。抑制Ku80蛋白表達(dá)的shRNA序列當(dāng)中,shRNA86轉(zhuǎn)染后A549細(xì)胞的Ku80表達(dá)量最低,與其陰性對照組相比具有顯著差異(p0.05)。所以選擇shRNA86轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。同時(shí),Ku80-cDNA轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞Ku80蛋白的相對表達(dá)量明顯高于其陰性對照組及正常未進(jìn)行轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞,說明Ku80-cDNA可以顯著增加A549細(xì)胞的Ku80蛋白表達(dá)。5. CCK8結(jié)果顯示抑制Ku80表達(dá)后,A549細(xì)胞的增殖能力與正常細(xì)胞相比明顯降低,而上調(diào)Ku80表達(dá)后A549細(xì)胞的增殖能力明顯提高。shRNA-scramble轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞以及空病毒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞與正常細(xì)胞相比,增殖能力無明顯變化。6.濃度梯度體外聯(lián)合化療測試結(jié)果顯示,同正常A549細(xì)胞相比,shRNA轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞對于聯(lián)合化療藥物的化療敏感性明顯增強(qiáng),而Ku80-cDNA轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞對于該聯(lián)合化療藥物的敏感性顯著降低。shRNA-scramble轉(zhuǎn)染后的A549細(xì)胞以及空病毒轉(zhuǎn)染后的A549細(xì)胞較正常A549細(xì)胞對于聯(lián)合化療藥物的敏感性無明顯差異。7.劃痕實(shí)驗(yàn)顯示shRNA轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞遷移能力明顯低于未轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞,而cDNA轉(zhuǎn)染后較轉(zhuǎn)染前A549細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)能力明顯增強(qiáng)。相應(yīng)陰性對照組同未轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞相比,遷移能力無明顯區(qū)別。8. Transwell結(jié)果證實(shí),shRNA感染后A549細(xì)胞的侵襲能力相對于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞顯著降低,而cDNA轉(zhuǎn)染后侵襲能力明顯增強(qiáng),二者相應(yīng)陰性對照組與未轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞的侵襲能力無明顯差異。9.流式細(xì)胞檢測表明,對于同一濃度的聯(lián)合化療藥物,shRNA轉(zhuǎn)染后的A549細(xì)胞凋亡率明顯增加,而cDNA轉(zhuǎn)染后的A549細(xì)胞凋亡率明顯下降。其相應(yīng)的兩個(gè)對照組與正常A549細(xì)胞的凋亡率無明顯差異。結(jié)論1.抑制Ku80基因的表達(dá)可以顯著降低肺腺癌細(xì)胞增殖、運(yùn)動(dòng)、遷移、侵襲能力,并增加其對順鉑聯(lián)合培美曲塞化療的敏感性2.過表達(dá)Ku80基因可以增加肺腺癌細(xì)胞增殖、運(yùn)動(dòng)、遷移以及侵襲能力,并顯著增強(qiáng)其對順鉑聯(lián)合培美曲塞化療的耐藥性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R734.2

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本文編號(hào)：2285190