【摘要】：第一部分基質(zhì)金屬蛋白酶和微小核糖核酸99a在卡波西樣血管內(nèi)皮瘤中表達(dá)情況的研究目的： 探討卡波西樣血管內(nèi)皮瘤中(kaposiform haemangioendothelioma, KHE)基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)和微小核糖核酸(micro ribonucleic acid, microRNA)相互作用。方法：收集重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院2004年至2013年間29例卡波西樣血管內(nèi)皮瘤病人標(biāo)本。所有病例均經(jīng)過病理學(xué)及臨床確診。運(yùn)用免疫組化、逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)、蛋白質(zhì)印記(Western blot)檢測KHE病人標(biāo)本中MMP3、MMP7、MMP9、MMP13和微小核糖核酸99a (miR99a)的表達(dá),使用雙變量相關(guān)分析分別計(jì)算MMPs和miR99a之間的相關(guān)系數(shù)。結(jié)果： KHE標(biāo)本中通過免疫組化、RT-qPCR、Western blot三種方法檢測到MNP7、MMP9、MMP13的表達(dá),但沒有檢測出MMP3的表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)基質(zhì)金屬蛋白酶7與MiR99a的表達(dá)水平有顯著意義的相關(guān)性(r=0.76；P0.001),基質(zhì)金屬蛋白酶13與MiR99a的表達(dá)水平也有顯著意義的相關(guān)性(r=0.81；P0.001),而基質(zhì)金屬蛋白酶9的水平與MiR99a的表達(dá)水平?jīng)]有相關(guān)性(r=0.0052；P=0.96)。結(jié)論：基質(zhì)金屬蛋白酶和微小核糖核酸與卡波西樣血管內(nèi)皮瘤的腫瘤發(fā)生有關(guān)�？úㄎ鳂友軆�(nèi)皮瘤中微小核糖核酸99a與基質(zhì)金屬蛋白酶7和基質(zhì)金屬蛋白酶13有密切相關(guān)性,與基質(zhì)金屬蛋白酶9沒有相關(guān)性。第二部分 微小核糖核酸99a通過調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶7和基質(zhì)金屬蛋白酶13控制卡波西樣血管內(nèi)皮瘤的侵襲性的研究目的：進(jìn)一步探索基質(zhì)金屬蛋白酶7和基質(zhì)金屬蛋白酶13通過微小核糖核酸99a調(diào)節(jié)來控制卡波西樣血管內(nèi)皮瘤的侵襲性的分子機(jī)制。方法：使用含20%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)一種人的卡波西樣血管內(nèi)皮瘤的細(xì)胞系(SLK)。再分別使用含有過表達(dá)的miR99a的質(zhì)粒和小分子干擾RNA轉(zhuǎn)染SLK細(xì)胞,48小時(shí)后通過RT-qPCR檢測鑒定miR99a表達(dá)情況。通過RT-qPCR、Western blot、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測miR99a高表達(dá)(SLK-miR-99a)和低表達(dá)的SLK細(xì)胞(SLK-ShmiR-99a)基質(zhì)金屬蛋白酶7、基質(zhì)金屬蛋白酶9和基質(zhì)金屬蛋白酶13的表達(dá),利用Transwell細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)觀察miR99a高表達(dá)和低表達(dá)的SLK細(xì)胞侵襲性的變化。在miR99a敲除的SLK細(xì)胞(SLK-ShmiR-99a)中分別使用PI3k/Akt信號通路阻斷劑LY294002和ERK/MAPK信號通路阻斷劑PD98059進(jìn)行干擾,通過RT-qPCR、 Western blot、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測miR99a敲除的SLK細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶7和基質(zhì)金屬蛋白酶13的表達(dá)。利用Transwell細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)觀察信號通路阻斷劑LY294002和PD98059對miR99a敲除的SLK細(xì)胞侵襲能力的影響。結(jié)果：通過RT-qPCR檢測證明SLK-miR-99a中miR99a表達(dá)明顯高于正常SLK細(xì)胞(p0.05),而SLK-ShmiR-99a中miR99a表達(dá)明顯低于正常SLK細(xì)胞(p0.05)。通過RT-qPCR, Western blot和ELISA實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)SLK-miR-99a細(xì)胞中MMP7和MMP13的表達(dá)明顯低于SLK-N細(xì)胞(p0.05),SLK-ShmiR-99a細(xì)胞中MMP7和MMP13的表達(dá)明顯高于SLK-N細(xì)胞(p0.05),而三種細(xì)胞的MMP9表達(dá)無明顯差異性(p0.05)。通過Transwell細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SLK-miR-99a實(shí)驗(yàn)組侵襲性明顯小于SLK-N實(shí)驗(yàn)組(p0.05),而SLK-ShmiR-99a實(shí)驗(yàn)組侵襲性明顯強(qiáng)于SLK-N實(shí)驗(yàn)組(p0.05)。通過RT-qPCR、Western blot和ELISE實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SLK-ShmiR-99a+ LY294002實(shí)驗(yàn)組SLK細(xì)胞MMP7的表達(dá)明顯低于SLK-ShmiR-99a細(xì)胞(p0.05),MMP13的表達(dá)與SLK-ShmiR-99a細(xì)胞無明顯差異(p0.05)；SLK-ShmiR-99a+ PD98059實(shí)驗(yàn)組SLK細(xì)胞MMP13的表達(dá)明顯弱于SLK-ShmiR-99a細(xì)胞(p0.05),MMP7的表達(dá)與SLK-ShmiR-99a細(xì)胞無明顯差異(p0.05)。Transwell細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SLK-ShmiR-99a+ LY294002和SLK-ShmiR-99a+ PD98059實(shí)驗(yàn)組SLK細(xì)胞的侵襲能力都弱于SLK-ShmiR-99a (p0.05),而他們之間比較無顯著性差異(p0.05)。結(jié)論：SLK細(xì)胞中微小核糖核酸99a通過調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶7和基質(zhì)金屬蛋白酶13影響KHE的侵襲性,而基質(zhì)金屬蛋白酶9似乎不受微小核糖核酸99a的調(diào)控。PI3k/Akt信號通路的抑制可以顯著消除微小核糖核酸99a的敲除對基質(zhì)金屬蛋白酶7的影響,但不能消除對基質(zhì)金屬蛋白酶13的影響,相反ERK/MAPK信號通路的抑制可以顯著消除微小核糖核酸99a的敲除對基質(zhì)金屬蛋白酶13的影響,但不能消除對基質(zhì)金屬蛋白酶7的影響。因此,微小核糖核酸99a、MMP7和MMP13有望成為治療卡波西樣血管內(nèi)皮瘤的令人期待的治療靶點(diǎn)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R730.26

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