發(fā)布時(shí)間：2018-10-21 10:51

【摘要】：胃癌是世界范圍內(nèi)癌癥相關(guān)性死亡的第二原因,盡管有先進(jìn)的診斷工具和治療方法,由于腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和耐藥,胃癌患者的五年的生存率仍不到30%。因此胃癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和耐藥仍是限制其療效的主要因素。尋找高度特異性治療靶標(biāo)是提高胃癌療效乃至根治的重要途徑,為研究胃癌的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制開辟了新途徑。近年來興起腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells, CSCs)理論為該途徑提供了新的思路。胃癌干細(xì)胞(gastric cancer stem cells, GCSCs)是胃癌發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的重要因素,對其進(jìn)行研究,尋找和鑒定特異性的GCSCs的分子標(biāo)志物,并且明確其相關(guān)分子的調(diào)控機(jī)制。在本研究中,我們使用流式細(xì)胞熒光分選和無血清成球培養(yǎng)的方法,從胃癌細(xì)胞系中分離/富集了胃癌干細(xì)胞亞群CD44和CD90,實(shí)時(shí)定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞系SNU-5和SNU-16中CD44和CD90陽性細(xì)胞高表達(dá)干性相關(guān)基因Sox 2、Oct-4和Nanog;無血清成球培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)表明SNU-5和SNU-16中CD44和CD90的陽性細(xì)胞的成球能力明顯強(qiáng)于其陰性細(xì)胞；移植瘤實(shí)驗(yàn)也表明同數(shù)量級的SNU-5和SNU-16中CD44和CD90的陽性細(xì)胞較其陰性細(xì)胞具有更強(qiáng)的腫瘤形成能力,上述結(jié)果從干性基因表達(dá)、自我更新能力和致瘤性等幾個(gè)主要方面證實(shí)了胃癌細(xì)胞系SNU-5和SNU-16中CD44和CD90陽性細(xì)胞具有CSCs的特性。體外Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SNU-5和SNU-16的GCSCs亞群CD44的陽性細(xì)胞較其CD90的陽性細(xì)胞具有更強(qiáng)的侵襲能力；而CCK8增殖實(shí)驗(yàn)檢測表明SNU-5和SNU-16的GCSCs亞群CD90的陽性細(xì)胞較其CD44陽性細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖能力,同時(shí)CD44和CD90陽性細(xì)胞的體內(nèi)移植瘤實(shí)驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)CD44陽性細(xì)胞形成的移植瘤浸潤周圍組織并有肺轉(zhuǎn)移,而CD90陽性細(xì)胞形成的移植瘤具有完整的包膜。我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)CD44陽性細(xì)胞呈EMT表型并具有高侵襲轉(zhuǎn)移潛能,CD90陽性細(xì)胞呈細(xì)胞周期表型具有高致瘤性的特性。通過基因芯片分析,我們篩選出在GCSCs亞群CD44和CD90陽性細(xì)胞中一系列差異表達(dá)的基因,發(fā)現(xiàn)ENO1在GCSCs亞群CD44陽性細(xì)胞中表達(dá)增高尤為突出,因此進(jìn)一步研究了ENO1在調(diào)控GCSCs亞群CD44陽性細(xì)胞中自我更新及侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及其可能的分子機(jī)制,并探討了其在胃癌標(biāo)本中表達(dá)的臨床意義。通過Western Blot檢測篩選出高表達(dá)ENO1的SNU-5和低表達(dá)ENO1的BGC-823的細(xì)胞模型,同時(shí)流式細(xì)胞熒光分析發(fā)現(xiàn)ENO1在SNU-5的細(xì)胞膜富集表達(dá),且SNU-5中ENO1與CD44陽性細(xì)胞具有共定位現(xiàn)象。利用慢病毒干擾SNU-5中CD44陽性細(xì)胞ENO1的表達(dá)后,可以顯著抑制SNU-5中CD44的陽性細(xì)胞的成球能力、成瘤能力和侵襲轉(zhuǎn)移能力；發(fā)現(xiàn)過表達(dá)ENO1后增強(qiáng)BGC-823中CD44陽性細(xì)胞的成球能力、成瘤能力和侵襲轉(zhuǎn)移能力。另外,本室制備靶向ENO1的功能性單抗21A3對SNU-5中CD44陽性細(xì)胞體外功能的影響實(shí)驗(yàn)表明,單抗21A3可以顯著抑制SNU-5中CD44的陽性細(xì)胞的成球和侵襲能力。對SNU-5中CD44陽性細(xì)胞和陰性細(xì)胞進(jìn)行基因芯片及信號通路分析,發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt信號通路改變最大。Western blot檢測在穩(wěn)定干擾ENO1的SNU-5中CD44陽性細(xì)胞的EMT標(biāo)志物Vimentin表達(dá)降低及細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1c-myc的下調(diào)表達(dá),以此同時(shí)E-cadherin和p21的上調(diào)表達(dá),伴隨PI3K/Akt信號通路Akt和P13K的磷酸化水平降低,膜ENO1和膜uPA蛋白也伴隨下調(diào),而過表達(dá)ENO1的BGC-823中CD44陽性細(xì)胞Akt和P13K的磷酸化水平上升,同時(shí)膜ENO1和膜uPA蛋白也表達(dá)上升,提示ENO1的作用可能通過Akt信號通路激活。對95例胃癌標(biāo)本免疫組化染色檢測結(jié)果顯示,與ENO1的表達(dá)成正相關(guān),而與患者的生存時(shí)間成負(fù)相關(guān),ENO1可以作為判斷胃癌預(yù)后的重要指標(biāo)。本文的主要結(jié)論如下：流式熒光分選和無血清成球培養(yǎng)是一種能夠成功分離/富集GCSCs的有效方法；所獲得的GCSCs亞群CD44和CD90陽性細(xì)胞具有自我更新、高成瘤、高侵襲轉(zhuǎn)移特性；其特性可能依賴于PI3K/Akt、Wnt信號通路、TGF-β信號通路和抗凋亡信號通路的活化；ENO1在GCSCs亞群CD44細(xì)胞維持干性和侵襲轉(zhuǎn)移調(diào)控中發(fā)揮重要作用,其調(diào)控作用的發(fā)揮可能主要依賴PI3K/Akt信號通路的激活。ENO1的表達(dá)與臨床病理參數(shù)成正相關(guān),與患者生存時(shí)間成負(fù)相關(guān),可以用作判斷胃癌預(yù)后的指標(biāo)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.2

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本文編號：2284876