【摘要】：第一部分流式細(xì)胞術(shù)檢測循環(huán)微泡方法及外周血標(biāo)本處理參數(shù)研究 目的：探討離心速度、離心時(shí)問、儲存條件及抗凝劑對血漿來源微泡(microvesicles, MVs)數(shù)量及大小分布的影響。 方法：離心獲取肝素及EDTA抗凝血無血小板血漿(platelet free plasma, PFP)及MVs, calcein-AM標(biāo)記MVs后,應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測、分析MVs數(shù)量及大小分布,研究不同離心條件(速度：16000×g和20500×g；時(shí)間：15、30和60分鐘)、儲存條件(PFP于-80℃儲存一周或四周：MVs于4℃儲存3-4天或一周：MVs于-80℃儲存一周或四周)及抗凝劑(肝素或EDTA)對循環(huán)MVs數(shù)量及大小分布的影響。 結(jié)果：經(jīng)calcein-AM標(biāo)記后,流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)EDTA抗凝血漿來源MVs與肝素抗凝血漿來源MVs均為小于1μm粒子,MVs大小主要分布于0.2-0.5μm之間,其次為0.5-0.8μm區(qū)間,而在0.8-1.0μm區(qū)間分布數(shù)量最少;MVs數(shù)量不受抗凝劑影響,但抗凝劑影響MVs大小分布；不同離心速度及時(shí)間對MVs數(shù)量及大小分布無明顯影響；肝素抗凝血漿來源MVs或PFP儲存不同時(shí)間顯著改變MVs數(shù)量及大小分布；EDTA抗凝血漿來源MVs數(shù)量及大小僅在MVs儲存于-80℃高達(dá)四周后受到影響。 結(jié)論：Calcein-AM能夠有效地從血漿中鑒定出MVs,可作為annexin-V的替代物用于標(biāo)記MVs行流式檢測。與肝素相比,EDTA能夠更好地保存MVs數(shù)量及大小。PFP于16000×g離心15分鐘足以滿足提取MVs的需要,這有利于標(biāo)本的批量處理。與MVs這一儲存狀態(tài)相比,PFP狀態(tài)是更好的儲存方法。該研究提供了MVs收集、儲存及分離提取的方法學(xué),為今后MVs作為疾病生物標(biāo)記物的研究提供了很好的指導(dǎo)。 第二部分多發(fā)性骨髓瘤患者循環(huán)微泡與疾病相關(guān)性研究 目的：研究多發(fā)性骨髓瘤患者循環(huán)骨髓瘤細(xì)胞來源MVs(multiple myeloma-derived MVs, MM-MVs)及骨髓瘤干細(xì)胞來源MVs數(shù)量與疾病臨床特征及其主要生化指標(biāo)的相關(guān)性,為今后MM-MVs作為多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma. MM)新型生物標(biāo)記物的確立提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)；初步探討骨髓瘤患者骨髓及尿液標(biāo)本中MVs的流式檢測。 方法：采用第一部分研究中確立的方法收集正常對照及MM患者外周血標(biāo)本,同時(shí)收集MM患者尿液及骨髓標(biāo)本,差異離心法獲取MVs, calcein-AM標(biāo)記后,流式細(xì)胞術(shù)分析MVs數(shù)量及其表面不同CD分子(CD138, CD38, CD45, CD19)表達(dá)特點(diǎn),統(tǒng)計(jì)分析正常對照與MM患者循環(huán)MVs數(shù)量及表面抗原表達(dá)差異,分析評估MM-MVs與MM臨床特征的相關(guān)性。 結(jié)果：CD138單個(gè)表面標(biāo)記可以鑒別正常對照及MM患者循環(huán)骨髓瘤細(xì)胞來源MVs,我們將calcein-AM+、CD138+、直徑小于1μm的粒子定義為MM-MVs, MM患者循環(huán)MM-MVs數(shù)量明顯高于正常對照,該結(jié)果表明MM-MVs具有診斷價(jià)值；MM患者循環(huán)MM-MVs數(shù)量與骨損害、腎損害呈明顯正相關(guān)關(guān)系,與臨床常用的提示腫瘤負(fù)荷及預(yù)后指標(biāo)乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase, LDH)、β2微球蛋白(β2-croglobulin, β2-MG)值正相關(guān);MM-MVs數(shù)量與臨床疾病分期、分型暫無相關(guān)性。CD38是除CD138外MM另一常用檢測指標(biāo),MM患者外周血循環(huán)CD138+CD38+MVs數(shù)量及其在總MVs中所占比例均明顯高于正常對照；MM患者循環(huán)CD138+CD38+MVs數(shù)量與β2-MG及LDH值有正相關(guān)關(guān)系,提示可用于檢測腫瘤預(yù)后。CD138-CD19+或CD38+CD45-是目前公認(rèn)的MM干細(xì)胞表面標(biāo)記,我們認(rèn)為表面具有這些標(biāo)記的MVs為MM干細(xì)胞來源。MM干細(xì)胞來源MVs數(shù)量(CD138-CD19+和CD38+CD45-MV數(shù)量之和)及其在總MVs中的比例明顯高于正常對照；MM患者干細(xì)胞來源MVs數(shù)量與β2-MG相關(guān)(r=0.461, p=0.047).患者骨髓及尿液標(biāo)本中也可檢出具有上述表面標(biāo)記的MVs。 結(jié)論：應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù),通過對MVs表面抗原的檢測,我們可在MM患者外周血中檢測到MM特異性MVs。這些循環(huán)MVs與MM常見臨床并發(fā)癥及預(yù)后指標(biāo)明顯相關(guān),有望成為新型MM生物標(biāo)記物用于臨床輔助診斷及預(yù)后判斷,并為今后從MM-MVs這一全新視角研究MM發(fā)病機(jī)制提供了有力的臨床依據(jù)。本研究首次檢出MM干細(xì)胞來源MVs,有力拓展了臨床MVs的研究寬度。骨髓及尿液標(biāo)本中同樣可檢測到MM特異性MVs,且尿液具有標(biāo)本獲取簡單無創(chuàng)的優(yōu)點(diǎn),有助于進(jìn)一步推進(jìn)MVs在MM中的應(yīng)用。 第三部分多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞微泡對腎小管上皮細(xì)胞作用及機(jī)制初探 目的：研究人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株RPMI8226、U266細(xì)胞來源微泡(MM-MVs)對人腎小管上皮細(xì)胞HK-2的作用并初步探討其機(jī)制,以人慢性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞株K-562細(xì)胞來源MVs作為疾病對照。 方法：RPMI8226. U266及K-562細(xì)胞經(jīng)無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后差異離心法獲取MVs,隨后作用于HK-2細(xì)胞。CCK-8法檢測不同濃度(1、5、10、50μg/ml)MVs處理不同時(shí)間(24、48、72h)后HK-2細(xì)胞的生長增殖情況；Annexin V-PI凋亡試劑盒檢測不同濃度MVs作用不同時(shí)間(24、48、72h)后HK-2細(xì)胞的凋亡及壞死情況；Western blotting檢測10μg/ml MVs作用48及72h后HK-2細(xì)胞內(nèi)caspase-3(凋亡指標(biāo))、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin (上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化指標(biāo))、p-MLKL (壞死性凋亡指標(biāo))及LC3(自噬指標(biāo))蛋白表達(dá)水平變化。 結(jié)果：CCK-8檢測發(fā)現(xiàn)不同濃度MM-MVs作用48h后能夠明顯抑制HK-2細(xì)胞的生長,而作用72h后MM-MVs對HK-2細(xì)胞的生長抑制作用明顯減弱；不同濃度K-562細(xì)胞來源MVs作用HK-2細(xì)胞不同時(shí)間對HK-2細(xì)胞生長無明顯影響。AnnexinV-PI標(biāo)記HK-2細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)檢測后發(fā)現(xiàn)不同濃度RPMI8226、U266細(xì)胞來源MVs作用HK-2細(xì)胞48h后細(xì)胞有明顯凋亡或壞死發(fā)生,且隨著MV濃度的增加凋亡率明顯升高,而作用72h后HK-2細(xì)胞呈現(xiàn)明顯凋亡抑制;K-562細(xì)胞來源MVs對HK-2細(xì)胞的凋亡或壞死無明顯影響。Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)10μ/ml MVs處理48h后,HK-2細(xì)胞內(nèi)caspase-3、 pMLKL、E-cadherin、N-cadherin及LC3蛋白表達(dá)增加,提示細(xì)胞發(fā)生凋亡、壞死性凋亡及自噬,而vimentin蛋白表達(dá)下降；K562-MVs作用48h后,上述蛋白變化不明顯。不同細(xì)胞來源MVs作用HK-2細(xì)胞72h后,細(xì)胞內(nèi)各蛋白變化趨勢與48h時(shí)基本相同。值得注意的是,與48h相比,MM-MVs處理HK-2細(xì)胞72h后,細(xì)胞內(nèi)caspase-3表達(dá)水平下降,提示72h時(shí)MM-MVs促HK-2細(xì)胞凋亡能力下降。 結(jié)論：MM-MVs作用于HK-2細(xì)胞48h后抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡性壞死及自噬,作用72h后HK-2細(xì)胞凋亡受抑；而K-562細(xì)胞來源MVs對HK-2細(xì)胞生長增殖及凋亡無明顯影響。這些結(jié)果提示,MM-MVs對HK-2細(xì)胞的作用具有疾病特異性,可能是MM腎損害的全新機(jī)制。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R733.3

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