【摘要】：RSL1D1(ribosomal L1-domain-containing 1),即細(xì)胞衰老抑制基因(CSIG,cellular senescence-inhibited gene),編碼一種核糖體蛋白,屬核糖體L1p/L10e家族。RSL1D1蛋白主要定位于核仁,在其N端和C端分別含有核糖體L1結(jié)構(gòu)域和賴氨酸富集區(qū)。研究表明,RSL1D1具有抑制細(xì)胞衰老、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增殖的功能。最近,本課題組發(fā)現(xiàn)RSL1D1可能與p53之間存在相互作用,推測RSL1D1可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。本研究旨在闡明RSL1D1在腫瘤細(xì)胞中的功能及其與p53之間的相互作用,為最終解析RSL1D1與腫瘤發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系提供重要實驗依據(jù)。首先,本項目研究了 RSL1D1表達(dá)水平的下調(diào)對腫瘤細(xì)胞增殖速率的影響。利用常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建慢病毒重組質(zhì)粒pLKO.1-shRNA,包裝用于敲低RSL1D1的慢病毒顆粒,感染人直結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116,經(jīng)抗生素篩選,獲得敲低RSL1D1的穩(wěn)定HCT116細(xì)胞株,并通過繪制生長曲線,分析RSL1D1的敲低對HCT116增殖速率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對照組相比較,RSL1D1被敲低后,HCT116的增殖速率明顯下降。接著,利用流式細(xì)胞術(shù)分析了 RSL1D1的表達(dá)下調(diào)對細(xì)胞周期的影響。將上述制備的RSL1D1被敲低的HCT116細(xì)胞經(jīng)乙醇固定,利用PI染色法進(jìn)行染色,然后利用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期。結(jié)果發(fā)現(xiàn),和對照組相比較,RSL1D1的敲低導(dǎo)致Sub-G1的明顯增加,表明RSL1D1的敲低促進(jìn)細(xì)胞凋亡,提示RSL1D1具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生存的功能。然后,研究了 RSL1D1的表達(dá)下調(diào)與細(xì)胞凋亡信號途徑關(guān)鍵分子Bax和Puma表達(dá)水平之間的關(guān)系。收集上述制備的RSL1D1被敲低的HCT116細(xì)胞,利用實時熒光定量PCR和免疫印跡法檢測Bax和Puma的mRNA和蛋白質(zhì)水平。結(jié)果顯示,RSL1D1的表達(dá)下調(diào)后,作為p53下游靶基因的促凋亡因子Puma的mRNA和蛋白質(zhì)水平明顯升高,而Bax的蛋白質(zhì)水平則沒有明顯變化,盡管其mRNA水平略有上升。本研究還發(fā)現(xiàn)RSL1D1的敲低導(dǎo)致p53負(fù)調(diào)控因子HDM2的蛋白質(zhì)水平明顯上升。提示RSL1D1可能通過抑制HDM2,從而調(diào)節(jié)p53的胞內(nèi)水平和活性,并進(jìn)一步通過抑制Puma促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生存。最后,研究了 RSL1D1與p53之間的相互作用。通過基因重組技術(shù)將編碼全長RSL1D1、RSL1D1(1-281)、RSL1D1(282-485)、RSL1D1(387-490)的核苷酸序列克隆至原核表達(dá)載體pGEX-5X-1或pGEX-6P-1,同時將全長p53基因克隆至另一原核表達(dá)載體pET-32a。將測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),并利用谷胱甘肽瓊脂糖凝膠或鎳瓊脂糖凝膠純化融合蛋白,用于研究RSL1D1與p53之間的相互作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn),RSL1D1能在體外與p53直接結(jié)合,并確定RSL1D1(387-490)參與結(jié)合p53。綜上所述,本項目的一系列研究結(jié)果揭示,RSL1D1可能通過直接與p53結(jié)合,調(diào)節(jié)p53的活性及Puma的胞內(nèi)水平,從而調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖與生存。這對于深入理解RSL1D1和p53在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用,為腫瘤治療提供新思路與新靶點具有重要意義。
[Abstract]:RSL1D1 (ribosomal L1-domain-containing 1), a cell senescence suppressor gene (CSIG,cellular senescence-inhibited gene), encodes a ribosomal protein, which belongs to ribosomal L1p/L10e family. RSL1D1 protein is mainly located in nucleoli and contains ribosomal L1 domain and lysine rich region at its N-terminal and C-terminal, respectively. RSL1D1 can inhibit cell senescence, regulate cell apoptosis and cell proliferation. Recently, our team found that there may be interaction between RSL1D1 and p53, suggesting that RSL1D1 may play an important role in tumorigenesis and development. The purpose of this study was to elucidate the function of RSL1D1 in tumor cells and its interaction with p53 in order to provide an important experimental basis for the final analysis of the relationship between RSL1D1 and tumorigenesis and development. First, we studied the effect of down-regulation of RSL1D1 expression on the proliferation rate of tumor cells. The lentivirus recombinant plasmid pLKO.1-shRNA, packaging was constructed by conventional molecular biology technique to knock down the lentivirus particles of RSL1D1. The stable HCT116 cell line with low RSL1D1 was obtained by antibiotic screening after infection with HCT116, and the growth curve was plotted. The effect of RSL1D1 knockout on the proliferation rate of HCT116 was analyzed. The results showed that compared with the control group, the proliferation rate of HCT116 decreased significantly after RSL1D1 was knocked down. Then, flow cytometry was used to analyze the effect of down-regulation of RSL1D1 expression on cell cycle. The RSL1D1 prepared above was immobilized by ethanol on the knockout HCT116 cells, stained by PI staining, and then the cell cycle was analyzed by flow cytometry. The results showed that compared with the control group, the knockout of RSL1D1 resulted in the increase of Sub-G1, which indicated that the knockout of RSL1D1 promoted cell apoptosis, suggesting that RSL1D1 could promote the survival of tumor cells. Then, the relationship between the down-regulation of RSL1D1 and the expression levels of Bax and Puma, the key molecules of apoptotic signaling pathway, was studied. The RSL1D1 knockout HCT116 cells were collected and the mRNA and protein levels of Bax and Puma were detected by real-time fluorescence quantitative PCR and Western blotting. The results showed that after down-regulation of RSL1D1 expression, the mRNA and protein levels of apoptosis-promoting factor Puma, the downstream target gene of p53, increased significantly, but the protein level of Bax did not change, although the mRNA level increased slightly. This study also found that RSL1D1 knockout significantly increased the protein level of p53 negative regulatory factor HDM2. It is suggested that RSL1D1 may regulate the intracellular level and activity of p53 by inhibiting HDM2, and further promote the survival of tumor cells by inhibiting Puma. Finally, the interaction between RSL1D1 and p53 was studied. The nucleotide sequences encoding full-length RSL1D1,RSL1D1 (1-281), RSL1D1 (282-485) and RSL1D1 (387-490) were cloned into the prokaryotic expression vector pGEX-5X-1 or pGEX-6P-1, by gene recombination and the full-length p53 gene was cloned into another prokaryotic expression vector pET-32a.. The recombinant plasmid was transformed into E. coli BL21 (DE3) and expressed by IPTG. The fusion protein was purified by glutathione agarose gel or nickel agarose gel to study the interaction between RSL1D1 and p53. The results showed that RSL1D1 could bind p53 directly in vitro, and confirmed that RSL1D1 (387-490) was involved in p53 binding. In conclusion, a series of results of this study suggest that RSL1D1 may regulate the proliferation and survival of tumor cells by directly binding to p53, regulating the activity of p53 and the intracellular level of Puma. It is of great significance to understand the role of RSL1D1 and p53 in tumorigenesis and development and to provide new ideas and targets for tumor therapy.
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R730.2

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 潘宗延 ,丁鼎樂;基于調(diào)節(jié)細(xì)胞生長的治癌新嘗試[J];世界科學(xué);2005年06期

2 彭岳;趙鐵建;謝海源;韋燕飛;;細(xì)胞培養(yǎng)實驗中一些細(xì)節(jié)問題的探討[J];中華中醫(yī)藥學(xué)刊;2009年06期

3 鄭麗君;夏文美;童村;;HeLa細(xì)胞的培養(yǎng)與使用[J];醫(yī)藥工業(yè);1983年10期

4 李少英;李月秋;朱金玲;;三種細(xì)胞生長狀況的觀察[J];佳木斯醫(yī)學(xué)院學(xué)報;1995年06期

5 嚴(yán)國俊;裴燕芳;朱貞宏;吳潔穎;潘金火;;實時細(xì)胞電子分析技術(shù)的應(yīng)用研究進(jìn)展[J];中國藥學(xué)雜志;2014年03期

6 陳必良,穆潤華,馬向東,王德堂,辛?xí)匝?鄭維國,嚴(yán)瑞蘭;特異性反義寡核苷酸對含HPV16的SiHa細(xì)胞的作用[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2000年03期

7 孟洪弟,戚豫,潘虹,吳希如;無線粒體DNA的ρ°206細(xì)胞的培養(yǎng)及其呼吸鏈功能損害[J];中國優(yōu)生與遺傳雜志;2000年03期

8 何秉燕;鄧長生;鄒典定;劉湘芬;易有榮;;G-CSF對洛伐他汀誘導(dǎo)的K562細(xì)胞內(nèi)酸堿度及凋亡的影響[J];中華血液學(xué)雜志;2006年07期

9 黃靜紅;李德如;閻國富;;蘿卜硫素對HaCaT細(xì)胞的影響研究[J];中國美容醫(yī)學(xué);2010年11期

10 章靜波,葉祝三;保護(hù)正常組織和細(xì)胞——腫瘤化療研究中的一個動向[J];國外醫(yī)學(xué)參考資料(腫瘤學(xué)分冊);1978年01期

相關(guān)會議論文 前10條

1 劉令九;趙小琳;岳立廣;徐艷玲;李淑焱;侯麗娟;隋紅;姜崴;謝寶生;李勇;劉兵;李海濱;;細(xì)胞工廠培養(yǎng)人胚肺二倍體細(xì)胞制備凍干甲型肝炎減毒活疫苗[A];2011中國生物制品年會暨第十一次全國生物制品學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2011年

2 宋征;;應(yīng)用Bhas42細(xì)胞試驗檢測22個腫瘤促長基因標(biāo)志物[A];2013年（第三屆）中國藥物毒理學(xué)年會暨藥物非臨床安全性評價研究論壇論文摘要[C];2013年

3 谷彬;張輝;喻澤蘭;;依地福新對Jurkat細(xì)胞生長抑制機(jī)制的研究[A];2009醫(yī)學(xué)前沿論壇暨第十一屆全國腫瘤藥理與化療學(xué)術(shù)會議論文集[C];2009年

4 武冬梅;李秀娥;葛莉亞;袁星;;雙酚-A對MCF-7細(xì)胞伏安行為的影響[A];第五屆全國環(huán)境化學(xué)大會摘要集[C];2009年

5 李曉飛;呂超;吳小榮;韓慶玲;王杰;易宗春;;鉛和鋁離子對K562細(xì)胞紅系分化的影響[A];全國生化/工業(yè)與衛(wèi)生毒理學(xué)學(xué)術(shù)會議論文集[C];2010年

6 宋為民;郭波;;復(fù)方甘草酸苷對HaCaT細(xì)胞表達(dá)AQP3的影響[A];2011全國中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2011年

7 劉魯明;錢華;陳震;林勝友;黃挺;;參麥注射液對腫瘤細(xì)胞環(huán)核甘酸的影響[A];全國中醫(yī)藥科研與教學(xué)改革研討會論文集[C];2000年

8 張雪玲;糜漫天;李等松;韋娜;張乾勇;楊志祥;;Lovastatin對HL-60細(xì)胞HMG-CoA還原酶mRNA表達(dá)及細(xì)胞增殖功能的影響[A];中國營養(yǎng)學(xué)會特殊營養(yǎng)第五屆學(xué)術(shù)會議論文摘要匯編[C];2002年

9 房佰俊;廖聯(lián)明;楊少光;史明霞;趙春華;;胎兒骨髓源原始干細(xì)胞分離純化及其生物學(xué)特性的初步研究[A];第九屆全國實驗血液學(xué)會議論文摘要匯編[C];2003年

10 李曉軍;朱傳東;汪萍;賈麗;陳芳芳;夏欣一;陳龍邦;;人Id3基因在A549細(xì)胞中的表達(dá)及對細(xì)胞生長功能的研究[A];第六屆全國免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會論文集[C];2008年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 記者 吳春燕 通訊員 寧習(xí)源 吳劍鵬;人類情緒可影響干細(xì)胞生長[N];光明日報;2014年

2 馮衛(wèi)東;老化干細(xì)胞可轉(zhuǎn)變成年輕干細(xì)胞[N];科技日報;2012年

3 常麗君;科學(xué)家闡明核內(nèi)周期運(yùn)作機(jī)制[N];科技日報;2011年

4 本版編輯邋杜華斌 邰舉 毛文波 顧鋼 陳超 何屹 毛黎;2007年世界科技發(fā)展回顧(六)[N];科技日報;2008年

5 通訊員 李靜;廈大教授發(fā)現(xiàn)細(xì)胞防癌“玄機(jī)”[N];廈門日報;2009年

6 永誠;美發(fā)現(xiàn)控制細(xì)胞生長的蛋白質(zhì)[N];中國醫(yī)藥報;2000年

7 記者 張孟軍;加找到刺激干細(xì)胞生長分子[N];科技日報;2001年

8 張?zhí)锟?干細(xì)胞研究精彩紛呈[N];中國醫(yī)藥報;2011年

9 邵薇/編譯;T細(xì)胞的非凡能力[N];北京科技報;2003年

10 經(jīng)天;控制細(xì)胞生長的蛋白質(zhì)[N];中藥事業(yè)報;2000年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 蔣淵;缺氧肝癌細(xì)胞中HIF-1和NF-κB的相互作用及其分子機(jī)制的研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

2 張廣;肝星狀細(xì)胞在肝癌細(xì)胞惡性行為中的作用及機(jī)制研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2015年

3 付托;活性氧族在CHO細(xì)胞補(bǔ)料批次培養(yǎng)中的作用、機(jī)制及調(diào)控研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2016年

4 彭林;重組凝血因子VII在CHO細(xì)胞中的高效表達(dá)[D];江南大學(xué);2017年

5 楊靜波;土貝母甲素對雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞的抑制作用及機(jī)制研究[D];吉林大學(xué);2017年

6 李麟;USP18在IFN-α抗乙肝病毒機(jī)制中的作用及調(diào)控研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2017年

7 楊小超;陽離子配體修飾的納米金用于細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)和微囊自組裝研究[D];重慶大學(xué);2010年

8 葉玲玲;基于生物素誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的HEK293細(xì)胞多基因代謝工程改造[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2011年

9 梁國斌;產(chǎn)朊假絲酵母生產(chǎn)谷胱甘肽過程控制與優(yōu)化[D];江南大學(xué);2008年

10 楊海虹;鈣池操縱性鈣內(nèi)流在人肺腺癌A549細(xì)胞中的研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2012年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 柯自立;硫酸鎂對6-羥基多巴胺損傷的SH-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)作用[D];福建醫(yī)科大學(xué);2015年

2 李婷婷;細(xì)胞穿透肽VP22對抑癌蛋白PTEN體外抗腫瘤作用影響的研究[D];川北醫(yī)學(xué)院;2015年

3 王靜;環(huán)氧化物酶抑制劑NS-398聯(lián)合奧沙利鉑對宮頸癌Hela細(xì)胞增殖和凋亡的影響[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

4 鄭祿祿;番茄紅素對轉(zhuǎn)染SOD1-G93A的PC12細(xì)胞線粒體的保護(hù)作用[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

5 宋晨源;氯化銨對人正常肝細(xì)胞系changliver中二氫乳清酸脫氫酶表達(dá)的影響[D];鄭州大學(xué);2015年

6 張莉;白藜蘆醇體外抑制腸道病毒71型的作用機(jī)制研究[D];蘇州大學(xué);2015年

7 高華武;富硒芪云抗腫瘤作用及其機(jī)制的實驗研究[D];安徽中醫(yī)藥大學(xué);2015年

8 宋加奎;丹參對人胃癌SGC-7901細(xì)胞化療敏感性的影響[D];安徽中醫(yī)藥大學(xué);2015年

9 許雅鑫;尼古丁對NCI-H1975和NCI-H460細(xì)胞促進(jìn)增殖作用及對PI3K/Akt通路的影響研究[D];山西醫(yī)科大學(xué);2015年

10 高娜;加減駐景方含藥血清對二氯化鈷誘導(dǎo)后ARPE-19細(xì)胞表達(dá)VEGF及HIF-1α的影響[D];青海大學(xué);2015年

，

本文編號：2279062