發(fā)布時間：2018-10-17 18:53

【摘要】：背景:結(jié)腸癌是消化道最為常見的惡性腫瘤,由于其發(fā)病率高,對人類社會帶來巨大的經(jīng)濟負擔(dān)。目前手術(shù)和放化療難以取得理想的療效,因此尋找新的治療方法來提高患者的生存率顯得尤為迫切。近幾年,一種新的治療方式--光動力療法(photodynamic therapy,PDT)逐漸被人們接受和關(guān)注,PDT以其并發(fā)癥少、創(chuàng)傷小、可重復(fù)應(yīng)用且與其它療法相互干擾影響小等優(yōu)點成為當(dāng)前最有推廣前景的生物療法。研究認為PDT誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的機制存在細胞特異性,而p53的突變很可能是減慢PDT誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生凋亡速度的重要原因之一。那么PDT殺傷結(jié)腸癌細胞是否呈現(xiàn)p53wt依賴性?p53wt是如何協(xié)同PDT殺傷結(jié)腸癌細胞的呢?這些疑問都亟待解決。目的:研究野生型p53介導(dǎo)PDT殺傷結(jié)腸癌細胞的作用機制,為PDT在結(jié)腸癌的臨床治療上提供科學(xué)依據(jù)。方法:1.體外研究通過MTT實驗比較p53wt和p53mut兩組細胞經(jīng)PDT處理后細胞活力變化;再用RKO和HT29、p53-/-HCT116和p53+/+HCT116細胞進一步驗證PDT處理后細胞活力變化;動物實驗選用RKO和HT29、p53-/-HCT116和p53+/+HCT116細胞分別進行裸鼠成瘤實驗,待腫瘤體積長到一定大小用PDT處理,觀察腫瘤體積變化并記錄各組實驗裸鼠的生存情況。2.在結(jié)腸癌組織樣品、RKO和HT29、p53-/-HCT116和p53+/+HCT116中檢測mi R-124的表達情況;并在四株細胞中驗證mi R-124和PDT對細胞活力的影響;設(shè)計合成mi R-124的完整啟動子,并按生物信息學(xué)預(yù)測的p53wt的結(jié)合位點設(shè)計截短的啟動子報告質(zhì)粒,借助雙熒光素酶實驗在p53wt RKO和p53+/+HCT116細胞中篩選并驗證具體的結(jié)合位點。3.在細胞和組織兩個層面研究mi R-124和i ASPP的表達水平;通過慢病毒包裝技術(shù)獲得慢病毒LV-sh-i ASPP,然后在RKO和HT29、p53-/-HCT116和p53+/+HCT116細胞中驗證LV-sh-i ASPP與PDT對細胞活力的影響;設(shè)計合成i ASPP基因的3'-UTR完整啟動子,并按生物信息學(xué)預(yù)測的mi R-124結(jié)合位點設(shè)計突變的3'-UTR報告質(zhì)粒,借助雙熒光素酶實驗在293細胞中篩選并驗證具體的結(jié)合位點。結(jié)果:1.3株p53mut結(jié)腸癌細胞活力明顯高于3株p53wt細胞株;細胞實驗PDT處理組p53mut HT29細胞株24小時和48小時的細胞活力均優(yōu)于p53wtRKO細胞株,p53-/-HCT116細胞株24小時和48小時的細胞活力均優(yōu)于p53+/+HCT116細胞株;動物實驗PDT處理組,p53mutHT29細胞成瘤后腫瘤體積同期均大于p53wtRKO細胞成瘤后腫瘤體積,p53-/-HCT116細胞成瘤后腫瘤體積同期均大于p53+/+HCT116細胞成瘤后腫瘤體積。2.mi R-124在結(jié)腸癌p53mut組織中、p53突變的結(jié)腸癌細胞及p53表達缺失的結(jié)腸癌細胞中均低表達;mi R-124可以降低HT29和RKO、p53-/-HCT116和p53+/+HCT116細胞活力,p53突變或缺失結(jié)腸癌細胞較p53wt細胞對PDT和mi R-124聯(lián)合處理表現(xiàn)出一定的耐受性;p53可以與mi R-124啟動子區(qū)域的B、C兩個位點作用,并促進mi R-124的表達。3.p53mut三株細胞中mi R-124表達水平均低于p53wt三株細胞,而i ASPP表達水平相反;18例組織樣品中,p53表達水平越高則mi R-124表達水平越高,i ASPP表達水平越低;干擾i ASPP可以降低結(jié)腸癌細胞活力,p53突變或缺失結(jié)腸癌細胞較p53wt細胞對PDT和sh-i ASPP聯(lián)合處理表現(xiàn)出一定的耐受性;mi R-124與i ASPP 3'-UTR的兩個位點都有作用,可以下調(diào)i ASPP的表達。結(jié)論:1.PDT處理可以明顯殺傷結(jié)腸癌細胞降低其細胞活力,而p53突變或缺失的結(jié)腸癌細胞株對PDT表現(xiàn)出一定的耐受性。2.p53wt可以與mi R-124啟動子區(qū)域兩個位點發(fā)生相互作用,并激活mi R-124啟動子的轉(zhuǎn)錄活性,上調(diào)mi R-124的表達水平協(xié)同PDT降低結(jié)腸癌細胞活性。3.mi R-124可靶向調(diào)控下游靶基因i ASPP;干擾i ASPP的表達可協(xié)同PDT降低結(jié)腸癌細胞活力;p53wt-mi R-124-i ASPP通路可介導(dǎo)PDT殺傷結(jié)腸癌細胞。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.35

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本文編號：2277631