【摘要】：【目的】1、分析2007年1月至2015年4月期間于本中心經形態(tài)學、免疫學、細胞遺傳學分型(MIC)確診并住院接受治療的447例初診急性髓系白血病(AML)患者的EVI1表達水平,分析其臨床和細胞遺傳學等特征,對EVI1高表達患者的細胞遺傳學特征進行深入分析。2、對151例處于第一次緩解期行清髓性異基因造血干細胞移植患者的EVI1表達特征和臨床意義進行分析,分析EVI1基因表達水平對患者預后的影響。3、采用基因芯片等技術手段篩選與EVI1高表達相關的微小RNA(micro RNA),并初步探討11p15重排導致EVI1高表達的機制�！痉椒ā�1、通過制備質粒標準品的方法建立EVI1絕對定量檢測的方法。利用建立的RQ-PCR方法對本中心447例初診AML患者的EVI1水平進行檢測,并收集患者的人口學、初診血細胞計數、形態(tài)學、細胞遺傳學和AML常見基因突變等資料;并對緩解率和緩解后的無白血病生存進行分析。2、回顧性分析了151例處于第一次緩解期接受清髓性異基因造血干細胞移植的AML患者,分析其臨床特點、移植類型、EVI1表達水平、細胞遺傳學特征和基因突變類型對患者預后的影響,并進行單因素和多因素的統(tǒng)計學分析。3、通過micro RNA表達譜分析研究與EVI1相關的micro RNA的水平變化并對顯著負相關的兩種micro RNA進行驗證以及靶基因預測;利用基因表達譜和RQ-PCR研究11p15重排的AML高表達EVI1的特點,并通過體外轉染試驗初步揭示11p15重排和EVI1高表達之間的聯系。【結果】1、成功構建了EVI1定量檢測的標準品,驗證了RQ-PCR的工作曲線,對正常骨髓單個核細胞的EVI1表達進行了檢測,分別為EVI1-1d:99.812±94.823/10000PBGD,MDS1EVI1:186.171±188.678/10000PBGD,c EVI1:1198.428±1266.043/10000PBGD(均值±標準差),界定了EVI1高低表達的界線值為10倍正常骨髓的均值。在447例初診AML中,EVI1高表達者為80例(占17.9%),EVI1低表達者為367例(占82.1%)。兩組的年齡、性別分布無明顯差異,兩組外周血血紅蛋白水平、白細胞計數、血小板計數均未見到明顯差異。形態(tài)學方面,M5和M6在EVI1高表達組顯著增多(p=0.0038和0.01),M3在低表達組中有增多的趨勢(p=0.08)。細胞遺傳學方面,顯著傾向于EVI1高表達組分布的核型為11q23/MLL重排、3q26重排、-7/7q-以及t(9;11)(p分別為0.0001,0.0001,0.0006,0.0135),尤其發(fā)現了5例存在重現性11p15重排的病例均伴有EVI1高表達(p0.0001)。擴大驗證后的12例11p15重排均發(fā)現EVI1高表達。而顯著傾向于在EVI1低表達組占優(yōu)勢的核型為正常核型、inv(16)、t(8;21)(p=0.001,0.009,0.002)。按照細胞遺傳學危險度的分組分布中,低中高危組均顯示兩組分布的顯著性差異(p0.0001,p=0.044,p0.0001),其中低、中危組在EVI1低表達組顯著占優(yōu)勢,而高危組則在EVI1高表達組占優(yōu)勢。AML常見突變方面,NPM1突變更傾向于分布于EVI1低表達組(p=0.0003)。結合了細胞遺傳許和分子突變特征的NCCN 2014關于AML危險度的分層,高危組更傾向分布于EVI1高表達組(p0.0001),而低危組傾向分布于EVI1低表達組(p0.0001)。對于≤60歲的患者,EVI1高表達組緩解率明顯低于EVI1低表達組,兩組CR率分別為37.5%v.s.69.4%,存在顯著性統(tǒng)計學差異(p0.0001)。兩組緩解后的無白血病生存也顯示類似趨勢(p=0.031)。對于11q23/MLL重排,高EVI1表達在M5亞型多見,但無明顯統(tǒng)計學意義(p=0.231),而t(11;19)(q23;p13)和t(6;11)(q27;q23)核型在EVI1高表達組顯示出優(yōu)勢的趨勢(p=0.077)。11q23/MLL重排中,EVI1高表達組的緩解率顯示出明顯低于低表達組的趨勢(p=0.061)。-7/7q-核型中,單獨-7占EVI1高表達組的比例更高(4/7),兩組的完全緩解率未見顯著性差異。應用FISH技術,發(fā)現3q26重排存在多種斷裂重排方式,并發(fā)現5例3q27、3q29重排為隱匿性3q26重排。2、151例處于第一次緩解期行清髓性異基因造血干細胞移植的患者中,EVI1高表達組和低表達組比較,年齡、性別、初診時外周血白細胞計數、骨髓原始細胞比例均無明顯差異;M5分型在高表達組更占優(yōu)勢(p=0.0015);細胞遺傳學構成上,11q23/MLL重排在高表達組更占優(yōu)勢(p0.0001),正常核型在低表達組更占優(yōu)勢(p0.0001)。細胞遺傳學危險度中低危組占EVI1低表達組的比例更高(p0.0001)。常見的AML突變在兩組構成中無明顯差異。EVI1高表達和低表達組接受不含照射的MAC方案的比例、接受親緣或無關供體的人數比、接受骨髓干細胞外周血造血干細胞和臍帶血干細胞來源的構成比均未見顯著統(tǒng)計學差異。而在接受骨髓和外周血造血干細胞混合輸注方面,EVI1高表達組為14例(44%)顯著高于EVI1低表達組(p=0.0039)。在HLA匹配情況方面,采用部分相合供體的EVI1高表達組患者例數為16例(50%),顯著高于EVI1低表達組(p=0.0333)。移植后所有患者均獲得造血重建,移植后1個月均獲得完全嵌合。100天內累積a GVHD(II-IV°)發(fā)生率為21%±5%,7例患者發(fā)生重度a GVHD(III-IV°)。累積c GVHD發(fā)生率為30%±10%。15例患者2年內出現廣泛型c GVHD�；颊�2年總體生存率為68.5%(59.9-76.5%);無事件生存率為67.4%(58.5-74.6%)。中位隨訪時間26個月(2-60個月)。EVI1高表達組24個月OS為52.8%(32.5-69.5%),較低表達組72.4%(63-80%)顯著降低(p=0.0122);LFS為56.7%(34.9-73.7%),同樣較低表達組76.1%(66.6-83.2%)顯著降低(p=0.0083)。以無復發(fā)死亡作為競爭性因素,EVI1高表達組24個月時的累積復發(fā)率顯著高于低表達組,分別為39.5%(20.9-57.6%)和22.5%(15.2-30.7%)(p=0.013)。針對LFS進行的單因素分析結果表明,EVI1低表達和中危的細胞遺傳學分組是有利于LFS的預后因素(p0.05),而針對OS進行的單因素分析表明,更低的年齡、EVI1低表達、ITD野生型、中低危的細胞遺傳學、NPM1野生型均為有利于OS的預后因素(p均0.05)。多因素分析結果表明,EVI1表達為LFS唯一的獨立預后因素,低表達有利于預后(HR=0.44,95%CI 0.23-0.84,p=0.014)。ITD突變和低危、中危的遺傳學分型為OS的獨立預后因素。野生型ITD有利于預后(HR=0.31,95%CI 0.15-0.63,p=0.001);低危核型利于預后(HR=0.11,95%CI 0.01-0.86,p=0.03),中危核型同樣有利于OS(HR=0.43,95%CI 0.24-0.78,p=0.005)。以NCCN 2014關于AML危險度分層取代細胞遺傳學分組和常見AML突變的單因素分析表明,EVI表達高低以及中危的NCCN分組對LFS的預后有顯著性影響,而多因素分析表明,僅有NCCN中危險度組為有利于OS的唯一有利因素(HR=0.37,95%CI 0.21-0.64,p=0.0004)�；诩毎z傳學分層對EVI1的分層分析表明,EVI1表達狀態(tài)對LFS和OS均未產生明顯影響。3、結合107例初診AML的micro RNA表達譜分析以及EVI1定量分析,篩選出與EVI1表達負相關的micro RNA為mi R-181a(Fold change 0.368,p=0.00018)、mi R-128b(Fold change 0.465,p=0.002)、mi R-181c(Fold change 0.470,p=0.001)、mi R-128a(Fold change 0.479,p=0.002),正相關的為mi R-151-3p、mir-500、mi R-143、mi R-199a-5p、mi R-363、mi R-148a、mi R-151-5p、mi R-125a-5p、mi R-99b。利用RT-PCR方法對驗證了71例初診AML的mi R-128a的相對表達在EVI1高表達和低表達組中存在顯著性差異(p=0.0015),mi R-181a的相對表達存在顯著性差異(p=0.05)。利用Targetscan預測mi R-128a的可能調節(jié)靶基因為HOXA9等HOX家族成員,mi R-181a的可能調節(jié)靶基因為Bcl-2。10例11p15重排的AML基因表達譜表明EVI1d型是NUP98重排白血病患者表達上調的主要形式,而ME(MDS1EVI1)剪接型表達則處于低水平。HOX家族中,HOXA3、HOXA4、HOXA5、HOXA7、HOXA9、HOXA10、HOXAB處于較高表達水平。RQ-PCR驗證證實8例t(7;11)((p15;p15)的EVI1表達中,c EVI1、EVI-1d升高,而MDS1/EVI1表達無明顯升高。利用NUP98/HOXA9、NUP98/HOXD8對K562細胞和293T細胞的轉染表明,NUP98/HOXA9對293T細胞的轉染后c EVI1的相對表達有所上升。通過構建的連接NUP98/HOXA9不同結構片段和EVI1啟動子區(qū)的熒光素酶報告系統(tǒng)發(fā)現GLFG段對EVI1啟動子活性有顯著影響。【結論】1、EVI1高表達在AML中發(fā)生率為17.9%,在M5中較為多見,常見的細胞遺傳學異常包括11q23/MLL重排、3q26重排、-7/7q-以及t(9;11)和11p15重排。高表達組緩解率明顯降低,這一趨勢同樣表現在單獨進行的11q23/MLL重排患者中。2、處于第一次完全緩解期接受清髓性異基因造血干細胞移植的AML患者,初診時EVI1高表達患者的無白血病生存率、總體生存率、累積復發(fā)率明顯差于低表達患者,EVI1是影響無復發(fā)生存的獨立預后因素。3、與EVI1表達負相關的micro RNA為mi R-128a,mi R-181a,預測的調控靶基因為HOXA9和Bcl2等。11p15致EVI1高表達的剪切體類型有獨特特征,利用NUP98/HOXA9轉染293T細胞后可導致EVI1表達上升。重組質粒轉染發(fā)現GLFG段對EVI1啟動子活性有顯著影響。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R733.71

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本文編號：2277371