【摘要】：研究目的1.研究NKD1在肝癌中的表達情況及其臨床病理意義。2.研究NKD1對肝癌細胞侵襲轉移能力的影響及其調(diào)控機制。3.研究NKD1對肝癌細胞增殖的影響及分子機制。研究方法1.收集臨床肝癌組織樣本,提取組織中的蛋白質,通過免疫印跡的方法檢測NKD1蛋白在配對新鮮組織中的表達情況并統(tǒng)計分析其表達差異;2.收集臨床肝癌實驗樣本,采用免疫組織化學染色的方法,檢測NKD1蛋白在肝癌組織中的表達定位和定量情況。根據(jù)免疫組化評估得分結果,采用卡方分析的統(tǒng)計學方法,探討NKD1的臨床病理意義;3.體外采用Transwell小室法研究“過表達”和“敲低”NKD1的蛋白表達后,肝癌細胞侵襲能力的改變情況。體內(nèi)通過建立裸鼠皮下移植瘤肺轉移模型研究NKD1對肝癌細胞侵襲轉移的影響;4.在過表達NKD1的同時過表達Rac1,通過功能恢復實驗和Transwell實驗證實Rac1在NKD1調(diào)控肝癌細胞侵襲轉移能力中的關鍵性作用;采用免疫激光共聚焦的實驗方法,檢測NKD1對肝癌細胞骨架重排的影響調(diào)控;5.采用免疫共沉淀和免疫熒光的方法檢測NKD1和Rac1蛋白的結合情況,通過范素化實驗探究NKD1促進Rac1降解的分子途徑;6.Real-time PCR實驗證實Rac1可促進NKD1的轉錄水平,通過熒光素酶報告系統(tǒng)檢測和細胞共轉染的方法證實Rac1對NKD1的轉錄激活是依賴于EZH2的;7.K-M生存統(tǒng)計分析Rac1和NKD1異常表達對肝癌患者不良預后的影響;8.采用CCK-8、Ed U實驗和克隆形成實驗,分析NKD1對肝癌細胞增殖能力的影響,體外通過皮下移植瘤模型實驗進行驗證;9.在NKD1過表達的同時,加入P53特異性的抑制劑,對比觀察細胞增殖指標PCNA的改變情況,證實NKD1對肝癌細胞增殖調(diào)控部分是依賴于P53的;Real-time PCR實驗檢測NKD1m RNA在肝癌中的表達水平,統(tǒng)計分析其表達量與肝癌患者的腫瘤大小和生存時間之間的臨床相關性。研究結果1.通過免疫印跡實驗檢測發(fā)現(xiàn),NKD1蛋白在肝癌中的表達量要明顯低于癌旁正常的肝組織(P0.01);2.通過對58例肝癌石蠟樣本進行NKD1免疫組化染色實驗發(fā)現(xiàn),NKD1在32例樣本中是處于低表達,并且其低表達與肝癌患者的不良分化(P=0.003)、肝內(nèi)外轉移(P=0.01)和腫瘤大小(P=0.011)密切相關;3.基質膠侵襲轉移實驗發(fā)現(xiàn),過表達NKD1可以明顯抑制肝癌細胞SMMC-7721和Huh7的遷移與侵襲,然而干擾NKD1的表達可促進Hep G2的侵襲轉移能力。體內(nèi)實驗研究發(fā)現(xiàn),通過皮下注射過表達NKD1-SMMC-7721細胞的裸鼠肺部組織和肝內(nèi)腫瘤轉移灶數(shù)量和轉移率均明顯低于對照組(P0.05),提示NKD1可以在體內(nèi)外有效抑制肝癌細胞的侵襲轉移能力。4.免疫印跡實驗發(fā)現(xiàn)NKD1過表達可以下調(diào)Rac1的蛋白水平,并且NKD1抑制肝癌細胞侵襲轉移的能力是依賴于Rac1的。機制探討發(fā)現(xiàn)NKD1可以通過調(diào)控Rac1進而影響肝癌細胞骨架重排。5.免疫熒光和免疫共沉淀發(fā)現(xiàn),NKD1與Rac1在細胞漿中存有結合并縮短Rac1的蛋白半衰期。另外,NKD1還可以促進Rac1的泛素化途徑依賴的蛋白降解;6.Rac1可以發(fā)過來促進NKD1的基因轉錄,機制探討發(fā)現(xiàn),Rac1可以減少EZH2的蛋白表達水平,進而促進了NKD1的轉錄激活;7.肝癌組織中NKD1的m RNA水平明顯低于癌旁正常肝組織,而Rac1的蛋白水平在肝癌中是呈現(xiàn)相對高表達。生存分析發(fā)現(xiàn),Rac1和NKD1同時異常表達的肝癌病人手術后生存時間明顯低于其他病人(P=0.029);8.CCK-8、Ed U和克隆形成實驗證實了NKD1負向調(diào)控肝癌細胞的增殖能力;體外皮下移植瘤模型也證實了這一點;9.NKD1過表達后,肝癌中p53和p21蛋白表達增加,而PCNA的表達量明顯減少。當加入p53特異性的抑制劑后,NKD1下調(diào)PCNA的作用明顯被消弱;10.NKD1m RNA水平與肝癌患者的腫瘤大小(P=0.002)和不良預后(P=0.029)明顯相關。研究結論1.NKD1蛋白在肝癌中的表達明顯低于癌旁正常肝組織,并且其低表達與腫瘤分化、轉移和大小密切相關;2.NKD1負向調(diào)控肝癌細胞的侵襲轉移能力,并且這一能力是依賴于Rac1的;3.NKD1在胞漿中與Rac1結合,并促進其泛素化依賴的蛋白酶體降解;4.Rac1可以通過抑制EZH2的蛋白表達量進而激活NKD1的轉錄;5.RAC1和NKD1異常表達的肝癌患者術后生存時間明顯縮短;6.NKD1負向調(diào)控肝癌細胞的增殖能力,并且部分是依賴于p53的;7.NKD1m RNA水平與肝癌患者腫瘤大小和不良預后相關。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：福建醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7

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本文編號：2276440