【摘要】：胃癌是最常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，也是人類主要的癌癥死亡原因之一。在我國(guó)，胃癌的死亡率僅次于肺癌和肝癌。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年新增胃癌病例高達(dá)數(shù)百萬(wàn)，其中我國(guó)占42％左右；全球每年因?yàn)槲赴┧劳龅娜藬?shù)約為80萬(wàn)，中國(guó)占35%。常規(guī)的胃癌治療手段包括手術(shù)、化療、放療、生物免疫治療等。手術(shù)治療仍是根治胃癌的最好選擇，但并不是所有的胃癌患者都可以進(jìn)行手術(shù)，而且術(shù)后容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差；化療和放療對(duì)胃癌的輔助治療具有重要意義，但其副作用太大，很容易破壞患者的免疫系統(tǒng)；生物免疫治療如腫瘤疫苗，多數(shù)還處于研發(fā)或臨床試驗(yàn)階段，治療效果還未可知。近年來(lái)，分子靶向治療成為腫瘤治療領(lǐng)域的一個(gè)新熱點(diǎn)，它符合胃癌異質(zhì)性明顯、生物學(xué)行為復(fù)雜等特點(diǎn)。分子靶向治療通過(guò)特異性靶向或調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞上異常表達(dá)的標(biāo)志性分子，阻斷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲或轉(zhuǎn)移，和放化療等傳統(tǒng)治療手段相比具有特異性強(qiáng)、選擇性高等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)的主要目的是構(gòu)建并篩選一種靶向膽囊收縮素II型受體（CCK2R）的重組毒素，通過(guò)細(xì)胞毒性試驗(yàn)及動(dòng)物試驗(yàn)獲得該重組毒素的殺細(xì)胞活性、抗腫瘤活性、毒理及安全性等成藥性評(píng)價(jià)，確定其臨床應(yīng)用價(jià)值，并初步建立該重組毒素臨床適用病例的分析方法，為臨床試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為設(shè)計(jì)胃癌的個(gè)性化治療方案提供指導(dǎo)。 本實(shí)驗(yàn)室前期根據(jù)CCK2R在正常細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞上表達(dá)量和親和力的巨大差異，以酰胺化的胃泌素17（G17）為導(dǎo)向與截短并經(jīng)修飾的綠膿桿菌外毒素（PE38）重組構(gòu)建了一種能靶向胃癌的免疫毒素rG17PE38。為了篩選出分子量更小，活性更好的重組毒素，我們利用基因工程手段分別以正向及反向的N端截短的G1（7G13、G14、rG13、rG14）及N端延長(zhǎng)的八肽膽囊收縮素CCK（8CCK9、CCK12、rCCK9、rCCK12）為導(dǎo)向與PE38融合構(gòu)建了8種重組毒素。這8種重組毒素在大腸桿菌中均以可溶性形式表達(dá)，但是細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明只有以反向的rG13、rG14、rCCK9和rCCK12為導(dǎo)向構(gòu)建的4種重組毒素對(duì)幾種胃癌細(xì)胞系和結(jié)腸癌細(xì)胞系具有殺傷活性，而且它們和rG17PE38相比，無(wú)論在表達(dá)量還是殺細(xì)胞活性上都沒(méi)有表現(xiàn)出優(yōu)勢(shì)，因此我們最終確定用rG17PE38進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 采用粗略純化與精細(xì)純化相結(jié)合的方式，對(duì)rG17PE38進(jìn)行了純化。首先用飽和硫酸銨沉淀法去除大部分雜質(zhì)，然后依次采用疏水層析、離子交換層析進(jìn)行精細(xì)純化，最后用凝膠過(guò)濾層析脫鹽。對(duì)飽和硫酸銨沉淀的條件（硫酸銨飽和度、pH值、沉淀時(shí)間等），層析條件（層析介質(zhì)、緩沖液pH、鹽濃度等）進(jìn)行了優(yōu)化。從純化結(jié)果看，經(jīng)40%飽和硫酸銨沉淀后，rG17PE38的純度大約可達(dá)50%左右；經(jīng)過(guò)疏水層析和離子交換層析后，純度可達(dá)92%左右；最后經(jīng)過(guò)脫鹽處理后，終純度達(dá)95%左右，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。 為了便于保存，我們對(duì)純化后的rG17PE38進(jìn)行凍干，并優(yōu)化了凍干條件；然后采用CCK-8毒性檢測(cè)試劑盒對(duì)凍干后的目的蛋白進(jìn)行活性和穩(wěn)定性分析；用間接免疫熒光方法對(duì)rG17PE38在靶細(xì)胞上的定位、內(nèi)化情況進(jìn)行了檢測(cè)；細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)分析了rG17PE38與受體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合情況；最后通過(guò)流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)rG17PE38是否可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明凍干后的rG17PE38活性幾乎沒(méi)有下降，而且在4℃至少可以放置10天左右，穩(wěn)定性良好；rG17PE38通過(guò)識(shí)別靶細(xì)胞上的CCK2R后快速定位到靶細(xì)胞表面，然后內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮毒性作用；而rG17PE38發(fā)揮毒性作用的機(jī)制之一就是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 為了進(jìn)一步分析rG17PE38的抗腫瘤活性，采用皮下接種胃癌懸液細(xì)胞的方式建立胃癌裸鼠模型，并用rG17PE38對(duì)荷瘤裸鼠進(jìn)行治療，觀察rG17PE38的抑瘤效果、對(duì)裸鼠生存期的影響、毒副作用以及獲得安全性評(píng)價(jià)等。皮下接種胃癌BGC-823細(xì)胞后15天左右成功建立了胃癌裸鼠模型，治療分高、中、低3個(gè)劑量組，其中高劑量組和中劑量組裸鼠的腫瘤生長(zhǎng)緩慢、無(wú)轉(zhuǎn)移而且生存期明顯延長(zhǎng)，組織切片病理結(jié)果顯示rG17PE38對(duì)裸鼠無(wú)明顯的毒副作用。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以預(yù)測(cè)rG17PE38是一種很有潛力的胃癌靶向治療藥物。 最后，，為了限定rG17PE38靶向的臨床病例范圍，以便以后能準(zhǔn)確地對(duì)胃癌患者進(jìn)行治療，我們初步建立了一種CCK2R的檢測(cè)方法。分別利用RT-PCR、western-blotting及熒光定量PCR方法對(duì)各種細(xì)胞及胃癌組織樣本中的CCK2R進(jìn)行定性和定量檢測(cè)，分析樣本中CCK2R的含量與rG17PE38有效性之間的關(guān)系，預(yù)測(cè)rG17PE38可能適用的臨床病例。檢測(cè)的20種細(xì)胞和20例臨床胃癌手術(shù)樣本中，其中有5種癌細(xì)胞和5例胃癌樣本檢測(cè)到CCK2R的表達(dá)，而且PCR與western-blotting方法的檢測(cè)結(jié)果一致。根據(jù)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物試驗(yàn)及胃癌患者的臨床病理診斷結(jié)果，我們初步預(yù)測(cè)14號(hào)、1號(hào)和20號(hào)患者可能是rG17PE38適用的病例。 總之，通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)我們分別從細(xì)胞及動(dòng)物水平證實(shí)了rG17PE38具有特異性靶向抵抗胃癌的能力，希望本實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果能為今后的臨床試驗(yàn)及胃癌個(gè)性化治療方案的設(shè)計(jì)提供一定的參考。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2276189