【摘要】：第一部分:FTO在人乳腺癌組織目的:分析乳腺癌組織與癌旁組織面FTO的表達(dá)差異,并探索FTO表達(dá)量與體重指數(shù)、腫瘤分期、組織分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、激素受體狀態(tài)、HER-2狀態(tài)等的關(guān)系。方法:1.收集樣本:收集2012年1月至2013年12月在廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院住院,經(jīng)行手術(shù)切除的79例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌及43例癌旁組織蠟塊標(biāo)本。腫瘤標(biāo)本均由病理醫(yī)師確診。所有患者均為女性,且術(shù)前患者未曾接受任何抗癌治療。2.應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測79例乳腺癌組織及43例癌旁組織面FTO蛋白的表達(dá)情況,并比較其表達(dá)差異,分析其與乳腺癌臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。結(jié)果:1.FTO在乳腺癌組織與癌旁組織的表達(dá)情況:FTO在乳腺上皮及乳腺癌組織FTO在乳腺癌組織的表達(dá)水平要明顯高于癌旁組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(78.5%vs 27.9%,p0.001)。2.FTO與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系:激素受體陰性或HER-2過表達(dá)患者的FTO表達(dá)水平要高于激素受體陽性或HER-2陰性患者(89.3%vs52.2%,p=0.001;97.2%vs 63.7%,p0.001)。乳腺癌組織分級為3級或P53陽性的患者其FTO表達(dá)水平似乎要高于組織分級低(1級或2級)或P53陰性的患者,差異接近達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(100%vs75%,p=0.082;90.9%vs 73.8%,p=0.077)。FTO蛋白的表達(dá)情況與乳腺癌TNM分期、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)、Ki67指數(shù)及體重指數(shù)(BMI)無明顯相關(guān)性(所有p值0.05)。3.FTO在不同乳腺癌分子分型中的表達(dá)情況:FTO在HER-2過表達(dá)乳腺癌中表達(dá)水平最高(97.1%),其次是三陰型乳腺癌(76.2%),最后是Luminal A/B1型乳腺癌(52.2%),三者間差異達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.001)。結(jié)論:1.FTO在乳腺癌組織的表達(dá)水平要高于癌旁組織;且激素受體陰性或HER-2過表達(dá)患者的FTO表達(dá)水平要高于激素受體陽性或HER-2陰性患者;乳腺癌組織分級為3級或P53陽性的患者其FTO表達(dá)水平似乎要高于組織分級低(1級或2級)或P53陰性的患者。2.FTO在不同分子分型乳腺癌中的表達(dá)有差異:FTO在HER-2過表達(dá)乳腺癌中表達(dá)水平最高(97.1%),其次是三陰型乳腺癌(76.2%),最后是Luminal A/B1型乳腺癌(52.2%)。3.我們的研究結(jié)果提示FTO可能在乳腺癌,尤其是HER-2過表達(dá)乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中起有重要作用。第二部分:FTO在人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB-231及乳腺上皮細(xì)胞HBL-100中的表達(dá)情況目的:分析不同分子類型人乳腺癌細(xì)胞株中FTO基因的表達(dá),找出優(yōu)勢表達(dá)株,為后面進(jìn)一步研究FTO在人乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲中的作用及其機(jī)制奠定基礎(chǔ)。方法:1.應(yīng)用蛋白質(zhì)免疫印跡方法檢測MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB-231及HBL-100細(xì)胞中FTO蛋白表達(dá)情況。2.應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR測定MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB-231及HBL-100細(xì)胞中FTO m RNA的表達(dá)。結(jié)果:1.實(shí)時(shí)熒光定量PCR的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),FTO在ER陰性人乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3及MDA-MB-231的m RNA表達(dá)水平要高于乳腺上皮細(xì)胞HBL-100,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.049,p=0.001);而FTO在MCF-7與HBL-100細(xì)胞之間表達(dá)無差異(p0.05)。2.蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果發(fā)現(xiàn),在人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB-231及作為對照的乳腺上皮細(xì)胞HBL-100中均檢測到了FTO蛋白的表達(dá),在SK-BR-3中FTO表達(dá)最高,其次是MDA-MB-231、MCF-7,HBL-100表達(dá)水平最低。四組間FTO蛋白表達(dá)的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。結(jié)論:1.ER陰性人乳腺癌細(xì)胞株SK-BR-3、MDA-MB-231中FTO蛋白水平和m RNA水平的表達(dá)均高于乳腺上皮細(xì)胞HBL-100中的表達(dá)。2.結(jié)合前期的免疫組化結(jié)果,我們選擇SK-BR-3細(xì)胞作為FTO的優(yōu)勢表達(dá)株,進(jìn)一步行以FTO為研究靶點(diǎn)的生物學(xué)功能試驗(yàn)。第三部分基于CRISPR/Cas9技術(shù)建立FTO基因敲除的SK-BR-3細(xì)胞目的:利用CRSPR/Cas9技術(shù)建立FTO基因敲除的SK-BR-3細(xì)胞系,旨在建立研究FTO的平臺,為探索FTO對SK-BR-3細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其分子機(jī)制夯實(shí)前期基礎(chǔ)。方法:根據(jù)CRISPR/Cas9基因敲除試劑盒操作流程構(gòu)建g RNA重組質(zhì)粒,利用Lipofectamine2000脂質(zhì)體介導(dǎo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞,通過GFP綠色熒光及嘌呤霉素對轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行篩選,并鑒定敲除效果。結(jié)果:1.根據(jù)CRISPR/Cas9系統(tǒng)sg RNA的設(shè)計(jì)原則,應(yīng)用http://crispr.mit.edu網(wǎng)站進(jìn)行輔助Cas打靶位點(diǎn)設(shè)計(jì),設(shè)計(jì)了3個(gè)打靶位點(diǎn):FTO sg RNA#1,GGAACGAGAGCGCGAAGCTAAGG;FTO sg RNA#2,GCGCGAAGCTAAGGTATGTCGGG;FTO sg RNA#3,GCTAAGGTATGTCGGGCTCCCGG。2.體外活性檢測提示FTO sg RNA#3的酶切效率最高,達(dá)90%,選擇用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。3.構(gòu)建了g RNA重組質(zhì)粒,并測序成功。4.脂質(zhì)體介導(dǎo)sg RNA#3重組載體感染SK-BR-3細(xì)胞。嘌呤霉素與綠色熒光蛋白對轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行了篩選。5.測序與蛋白質(zhì)免疫印跡方法從DNA和蛋白水平鑒定FTO敲除成功。結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)通過CRISPR/Cas9技術(shù)成功獲得了FTO基因敲除的SK-BR-3細(xì)胞。該細(xì)胞用于后續(xù)研究FTO表達(dá)對細(xì)胞生物學(xué)行為能力的影響。第四部分FTO基因敲除對SK-BR-3細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力的影響目的:探索FTO表達(dá)改變對SK-BR-3細(xì)胞生物學(xué)行為能力的影響。方法:1.應(yīng)用CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)及克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測FTO基因敲除前后細(xì)胞增殖能力的變化;2.應(yīng)用劃痕實(shí)驗(yàn)及遷移實(shí)驗(yàn)檢測FTO基因敲除前后細(xì)胞遷移能力的變化;3.應(yīng)用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測FTO基因敲除前后細(xì)胞體外侵襲能力的變化。結(jié)果:1.CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)及克隆形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),FTO基因敲除后,SK-BR-3細(xì)胞的增殖能力沒有改變(p0.05);2.劃痕實(shí)驗(yàn)及transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),FTO基因敲除后,SK-BR-3細(xì)胞的遷移、侵襲能力下降(p0.01)。結(jié)論:本研究發(fā)現(xiàn)FTO表達(dá)水平改變可影響SK-BR-3細(xì)胞的遷移、侵襲能力,這結(jié)果將可能為乳腺癌的治療提供新思路。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.9

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本文編號：2272576