【摘要】：背景胰腺癌是消化道常見惡性腫瘤,40歲以上年齡人群較為好發(fā),男性比女性多見,其比例約為1.3:1,預后極差,死亡率在世界上排名第四。近年來,胰腺癌的發(fā)病率逐年上升,1988年,美國的發(fā)病率9.0/10萬。瑞典的發(fā)病率較高,達到125/10萬人,并在過去的20年保持不變。英國和挪威則有近一倍數(shù)量的增加。20世紀70年代與60年代相比,加拿大,丹麥和波蘭發(fā)病率也有近五成的增加。在中國,胰腺癌已成為死亡率前十名的惡性腫瘤之一。上海,天津等高發(fā)區(qū)近20年增長了4倍,近年來,北京協(xié)和醫(yī)院胰腺癌患者數(shù)量在醫(yī)院歷史上比上世紀50年代高出5?6倍。而據(jù)北京地區(qū)354例案例分析,近80%胰腺癌患者年齡在41至70歲,年輕胰腺癌患者比10年前有不斷上升的趨勢,且惡性程度更高,預后更差。目前提高胰腺癌患者存活率的唯一方法是進行手術(shù)切除,但85%的患者在治療時已經(jīng)屬于晚期,只有約10%至15%的患者可以接受手術(shù)治療,術(shù)后1年生存率僅為25%,手術(shù)后5年平均生存率不到5%,并且在過去30年里一直沒有顯著提高。除了手術(shù),化療也是目前治療進展期胰腺癌、預防術(shù)后復發(fā)、延長病人生存時間和提高生活質(zhì)量的重要手段之一。胰腺是一個既有外分泌功能又有內(nèi)分泌功能的內(nèi)臟器官。從體積上來說,執(zhí)行外分泌功能的結(jié)構(gòu)在胰腺中占的比例比較大,分泌出含有多種消化酶的胰液,胰液通過胰腺導管流入腸道,幫助消化食物。由于消化道是與外界相通的,所以稱為外分泌,這部分如果發(fā)生炎癥,將會使強大的消化酶進入腹腔,造成胰腺炎;這部分的細胞發(fā)生癌變,就是胰腺癌。胰腺導管癌占胰腺癌80%至90%,胰腺導管上皮細胞增生和其發(fā)生有著密切關(guān)系,在一些手術(shù)切除的標本中也發(fā)現(xiàn)了胰腺導管癌與胰腺導管上皮增生共同存在的現(xiàn)象。因而胰腺導管上皮增生可能是胰腺癌的癌前病變。有學者報道胰腺導管上皮增生的發(fā)病率為57%,胰腺癌的發(fā)生率為10%。胰腺癌進展快、轉(zhuǎn)移早、預后差、誤診率比較高。由于早期診斷十分困難,因此一旦做出診斷85%都已經(jīng)是中晚期的腫瘤。由于它的生物學特性表現(xiàn),現(xiàn)在被公認為癌中之王,它是21世紀醫(yī)學頑固的堡壘。因此,尋找更加敏感、特異的腫瘤標志物,使之與影像學方法相結(jié)合,成為有效篩查工具的需求十分迫切;加強胰腺癌發(fā)生、發(fā)展的分子生物學機制研究,為胰腺癌的早期診斷以及治療提供有益的線索成為目前研究的熱點。micro RNA(簡稱miRNA)是一類由基因組編碼、細胞內(nèi)源表達的、長度約為22nt的非編碼小RNA。它通過降解靶基因m RNA或抑制其翻譯過程,來調(diào)控真核細胞的基因表達。是廣泛存在于真核生物中的一組短小的、不編碼蛋白質(zhì)的RNA家族,它們是由19-23個核苷酸組成的單鏈RNA;表達具有組織特異性和階段特異性;與靶m RNA 3’-UTR結(jié)合,序列特異性的在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的翻譯表達,在生物發(fā)育、脂肪代謝、細胞的分化、增殖和凋亡等過程中發(fā)揮著重要作用;miRNA具有高度保守性,即各種miRNA都能在其他種系中找到同源體。miRNA可作為腫瘤抑制劑或致癌物在起作用,特異的miRNA表達或高表達的miRNA可以用來探討腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程。在正常組織和腫瘤組織中miRNA的表達變化,這些特征是miRNA可能成為一種生物標記物和治療藥物作用腫瘤診斷新的方向。因為大多數(shù)癌基因會導致癌癥,因此可以設(shè)計一些人工miRNA阻礙其表達,從而抑制腫瘤的形成。目前,腫瘤與miRNA之間的關(guān)系進行了大量的研究,如胃癌、鼻咽癌、肝癌、舌鱗狀細胞癌、肺癌、惡性淋巴瘤、乳腺癌等。miRNA的作用是多方面的,它改變細胞的命運形式是可以通過關(guān)閉一些關(guān)鍵基因?qū)嵭?而且其靶基因產(chǎn)物相互作用形成一個環(huán)路,與其他通路形成網(wǎng)絡調(diào)控關(guān)系,目前研究證實,人類30%的m RNA均通過某些機制處于miRNA調(diào)控下,隨著研究的深入,其作用機制被更多地展現(xiàn)出來,將會給人類帶來更多的福音。miR-184是一個位于小鼠9號染色體的印記基因,有著高度保守性。于2006年首次在哺乳動物細胞中被發(fā)現(xiàn)存在著表達,并且在小鼠的角膜上皮細胞中呈現(xiàn)高表達。研究結(jié)果顯示,miR-184對干細胞的生長以及增殖有著關(guān)鍵的作用。隨著研究的深入,在多種類型的腫瘤中也已發(fā)現(xiàn)了miR-184的表達發(fā)生改變,但其作用機制仍未完全明白。研究顯示,在神經(jīng)母細胞瘤中miR-184高表達時能夠誘導腫瘤細胞的凋亡和生長周期停滯。采用實時定量PCR對舌鱗狀細胞癌20例患者和156例健康對照者血漿中的miRNA進行檢測,在舌鱗癌患者血漿中發(fā)現(xiàn),miR-184有異常高表達,通過對血漿中miR-184表達進行抑制可以減少舌鱗癌細胞的增殖率,手術(shù)切除癌組織后血漿中miR-184水平相應降低。因此,血漿miR-184對舌鱗狀細胞癌診斷及治療療效評估有一定價值。已有研究表明,PI3K家族蛋白參與細胞的增殖、分化和凋亡等生理過程的調(diào)控。PI3K有著一個龐大與功能復雜的大家庭,I型、II型、III型是其結(jié)構(gòu)上的分型。其中I型PI3K又包含了兩個亞型,IA和IB,他們從G蛋白偶聯(lián)受體和酪氨酸激酶連接受體有著信號轉(zhuǎn)導。PI3K中的IA型是由催化亞基是P110和調(diào)節(jié)亞基p85亞基組成的二聚體蛋白,具有雙重活性的脂質(zhì)和蛋白激酶。在正常細胞中,PI3K的活性受到多種機制的嚴格控制。一般來說,在靜息狀態(tài)下,無活性的p1lo-P85絡合物被發(fā)現(xiàn)在細胞質(zhì)中,等待合適的信號激活。PI3K激活的方式有兩種:一是對生長因子受體或結(jié)合蛋白相互作用的酪氨酸殘基磷酸化,導致兩聚合物的構(gòu)象變化和激活。RTK信號是從配體所介導的蛋白激酶所活化,導致細胞內(nèi)的酪氨酸殘基的磷酸化。酪氨酸殘基磷酸化迅速成為細胞內(nèi)信號蛋白的相應結(jié)合位點,結(jié)合到細胞膜p85-p110 SH2結(jié)構(gòu)域并與P85形成復合體而被活化。另一種是通過RAS和P110的直接結(jié)合,從而激活PI3K信號通道。Akt也被稱為蛋白激酶B(PKB),這是類似于蛋白激酶A(PKA)和蛋白激酶C(PKC),是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,相對分子量為60000。可以直接磷酸化Akt相關(guān)的多種轉(zhuǎn)錄因子,通過這些轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié),可以抑制凋亡基因的表達,增強抗凋亡基因的表達,從而促進細胞的存活。此外,AKT還可以調(diào)節(jié)兩種轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和Bcl-2。NF-κB信號通路和許多細胞因子和生長因子在細胞分化、凋亡和存活有密切關(guān)系。在正常情況下,核因子-κB在細胞質(zhì)中,它的抑制劑Ⅰ-κB與其結(jié)合在一起,轉(zhuǎn)錄活性被抑制。Akt-lkk在介導NF-κB降解和NF-κB激活是必需的,是NF-κB依賴的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的關(guān)鍵過程,從而促進腫瘤細胞的存活起著重要的作用。除了凋亡和抗凋亡基因,Akt的促凋亡蛋白的直接磷酸化而促進細胞存活。此外,Akt可直接抑制半胱氨酸天冬氨酸-9活動。caspase-9的磷酸化可以促使Akt的活性喪失,從而中斷下游信號。PI3K-Akt信號通路參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程,即通過抑制細胞凋亡,細胞缺氧和營養(yǎng)缺乏的耐受性增強,促進腫瘤的生長。目的miR-184是一種與腫瘤關(guān)系十分密切的分子,直接與腫瘤的發(fā)病進展有關(guān),很可能是一種抑癌因素。但是miR-184在胰腺導管癌中表達情況目前仍未十分清楚,miR-184異常表達是否與胰腺導管癌細胞的侵襲、遷移、凋亡與細胞周期等生物學行為有關(guān)系,目前仍不得而知。因此,在本研究中,將胰腺導管癌中的miR-184表達水平作為研究對象,研究胰腺導管癌組織中miR-184表達水平,研究miR-184表達與胰腺導管癌的一系列病理臨床數(shù)據(jù)的關(guān)聯(lián),探討miR-184表達與患者生存期的相關(guān)性。同時對miR-184與胰腺導管癌的臨床病理數(shù)據(jù)進行了研究,進一步研究miR-184對胰腺導管癌細胞的生物行為的影響。通過體外細胞系實驗,研究探討miR-184對胰腺導管癌細胞的生長、遷移、侵襲以及凋亡方面的作用,探討miR-184調(diào)控的PI3K-AKT信號通路在胰腺導管癌進程中的作用。方法1 HE染色法確認實驗納入標準:臨床診斷為胰腺導管癌,且未接受任何輔助治療。胰腺導管癌根治性切術(shù)后胰腺癌組織標本和正常胰腺組織標本,經(jīng)HE染色后組織形態(tài)學觀察確認為胰腺導管癌。2 RT-PCR檢測miR-184表達水平:檢測組織中的miR-184表達水平。3 miR-184表達水平與患者臨床病理參數(shù)及預后的關(guān)系:miR-184表達水平與胰腺導管癌患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系采用Mann Whitney U和Kruskal Wallis檢驗,miR-184表達水平與患者預后之間的關(guān)系采用Kaplan Meier進行檢驗。4細胞劃痕實驗檢測細胞的遷移能力:胰腺導管癌細胞系CFPAC-1轉(zhuǎn)染miR-184促進其表達,然后將細胞種植于培養(yǎng)板內(nèi),待細胞長滿后,進行劃痕實驗,然后每天觀察細胞生長遷移情況,以評估m(xù)iR-184表達陽性的癌細胞遷移的情況。5 Transwell實驗檢測細胞的細胞侵襲能力:胰腺導管癌細胞系CFPAC-1轉(zhuǎn)染miR-184促進表達后,將細胞置于Transwell小室上層,繼續(xù)培養(yǎng)48小時后,顯微鏡下觀察穿過小室的細胞數(shù),分析細胞的侵襲能力。6流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡及細胞周期:胰腺導管癌細胞系CFPAC-1轉(zhuǎn)染miR-184,同樣陰性轉(zhuǎn)染作為對照,轉(zhuǎn)染48小時后,收集細胞,采用Annexin V和Propidium Iodide染色,染色后采用流式細胞儀進行分析,檢測細胞凋亡與細胞周期情況。7探討miR-184調(diào)控腫瘤細胞凋亡機制:western blot檢測PI3K/AKT與JNK信號通路與miR-184的關(guān)系。結(jié)果1對胰腺導管癌組織及正常胰腺組織中miR-184表達水平進行檢測,結(jié)果顯示,在胰腺導管癌組織中miR-184表達水平下降,統(tǒng)計學分析表明癌組織內(nèi)miR-184表達水平明顯低于正常組織(P0.05)。2癌組織中miR-184表達水平低的胰腺導管癌患者預后更差,生存時間更短(P0.05),提示miR-184與患者預后呈正相關(guān),miR-184可能在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮了功能。3細胞劃痕實驗結(jié)果表明,當CFPAC-1細胞過表達miR-184以后,細胞遷移速率較對照組癌細胞明顯下降,P0.05。將過表達miR-184的CFPAC-1細胞種植到帶有基質(zhì)膠的Transwell小室,培養(yǎng)48小時后發(fā)現(xiàn),過表達miR-184的CFPAC-1細胞穿過Transwell小室的能力低于對照組,二者之間比較具有明顯的統(tǒng)計學差異。上述表明,miR-184潛在的具有抑制CFPAC-1細胞遷移和侵襲的能力,當細胞的miR-184過表達后,CFPAC-1細胞的遷移和侵襲能力明顯下降。4在細胞過表達miR-184及用抑制劑抑制其表達后,相比于陰性轉(zhuǎn)染的CFPAC-1細胞,miR-184過表達的細胞的凋亡率明顯上升,抑制其表達后,凋亡率隨之下降,二者相比較,具有統(tǒng)計學意義。5過表達miR-184的CFPAC-1細胞與對照組、inhibitor組相比G1期明顯延長,S期明顯縮短,細胞生長延滯。6通過對miR-184進行抑制,能夠促使PI3K及AKT磷酸化水平增高、JNK1的活化,從而抑制細胞的凋亡。7在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中,c-myc、E2F1及C-Jun基因的激活及調(diào)節(jié)異常導致細胞的不可控生長和異常分化,引起細胞的惡變。阻斷c-myc、E2F1及C-Jun基因的表達對腫瘤細胞的影響已被廣泛研究,本結(jié)果顯示,通過對miR-184進行抑制,能夠促使c-myc、E2F1及C-Jun基因的激活,從而促進腫瘤細胞增殖、抑制細胞的凋亡,引起細胞的惡變。8對凋亡相關(guān)蛋白進行檢測,結(jié)果顯示,通過對miR-184過表達,能夠促使caspase-9、caspase-7及caspase-3表達水平升高,而Bcl-2表達水平降低,由此推斷miR-184促進腫瘤細胞的凋亡的機制之一是對PI3K/AKT及JNK信號通路進行抑制而實現(xiàn)的。結(jié)論1胰腺導管癌中miR-184的表達水平較正常胰腺組織明顯降低,提示miR-184與胰腺導管癌具有相關(guān)性。2胰腺導管癌組織內(nèi)miR-184表達水平與病理組織學分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移灶有明顯的相關(guān)性,因此推測miR-184與胰腺導管癌的惡性程度及侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān);miR-184低表達的胰腺導管癌患者預后差,生存期更短,因此推測miR-184可能抑制了胰腺導管癌的惡性進展。3 miR-184低表達能夠促進胰腺導管癌細胞生長、抑制其凋亡、促進癌細胞增殖侵襲轉(zhuǎn)移,因此推測miR-184可能是胰腺導管癌的潛在的治療靶點之一。4 miR-184促進胰腺導管癌細胞凋亡的機制之一是通過抑制PI3K/AKT及JNK信號通路活化實現(xiàn)的。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.9

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本文編號：2271557