【摘要】：目的:1.探討食管鱗癌組織PD-L1表達(dá)與臨床病理特征、放射敏感性以及預(yù)后之間的關(guān)系;2.研究食管癌細(xì)胞株Eca109經(jīng)電離輻射后,PD-L1表達(dá)的時(shí)間-劑量效應(yīng)關(guān)系;觀察放射線聯(lián)合PD-L1調(diào)控對(duì)細(xì)胞增殖、周期、凋亡和放射敏感性的影響,初步探討影響放射敏感性的機(jī)制。方法:1.通過免疫組化檢測(cè)食管鱗狀細(xì)胞癌和正常食管粘膜中PD-L1表達(dá),采用腫瘤細(xì)胞染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞比例進(jìn)行計(jì)分來確認(rèn)PD-L1在組織中反應(yīng)強(qiáng)度,統(tǒng)計(jì)分析PD-L1表達(dá)與腫瘤長(zhǎng)度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、病理分級(jí)等臨床病理特征、放射敏感性以及預(yù)后的相關(guān)性。2.使用RT-PCR和Western blotting檢測(cè)不同劑量X線照射后食管癌細(xì)胞株Eca109中PD-L1 m RNA和蛋白表達(dá)水平,CCK-8檢測(cè)食管癌細(xì)胞增殖情況,研究PD-L1時(shí)間-劑量效應(yīng)關(guān)系,摸索后續(xù)研究最適照射劑量。3.利用RNAi技術(shù)調(diào)控食管癌中PD-L1表達(dá),通過RT-PCR檢測(cè)干擾前后食管癌細(xì)胞株中PD-L1 m RNA表達(dá),CCK-8和FCM檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后食管癌細(xì)胞株增殖和凋亡情況。并比較6Gy下Eca109組、Eca109-N組、Eca109-P組的細(xì)胞增殖、周期、凋亡和放射敏感性的影響,初步探討影響放射敏感性的機(jī)制。結(jié)果:1.PD-L1表達(dá)與食管鱗癌的相關(guān)性1.1 PD-L1在食管鱗癌中表達(dá)免疫組化SP法驗(yàn)證:食管癌組織中PD-L1陽(yáng)性表達(dá)率為56.7%(51/90)明顯高于正常食管黏膜組織15.0%(3/20),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。1.2 PD-L1表達(dá)與食管鱗癌臨床病理特征的相關(guān)性PD-L1蛋白表達(dá)水平與食管鱗癌患者的年齡、性別、部位、最大直徑、病變長(zhǎng)度、周圍組織侵犯、原發(fā)腫瘤分期、臨床分期及原發(fā)腫瘤體積無顯著相關(guān)性(P0.05),與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有顯著相關(guān)性(P0.05)。1.3 PD-L1表達(dá)與放射敏感性的關(guān)系90例食管鱗癌放射治療后3月內(nèi)使用食管鋇餐進(jìn)行療效評(píng)價(jià),其中放射敏感組(CR+PR)68例,放射抗拒組(NR)22例。放射敏感組PD-L1陽(yáng)性表達(dá)率63.2%(43/68)明顯高于放射抗拒組39%(8/22),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.888,P0.05)。1.4 PD-L1與接受根治性放療的食管鱗癌患者的預(yù)后關(guān)系PD-L1表達(dá)陽(yáng)性組3年無疾病生存率28.4%,陰性組是19.8%。而PD-L1陽(yáng)性組3年總生存率是31.9%,陰性組是20.9%。經(jīng)Kaplan-Meier單因素分析兩組無疾病生存率(PFS)及總生存率(OS)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型多因素分析也發(fā)現(xiàn)PD-L1表達(dá)水平不是食管鱗癌的獨(dú)立預(yù)后因素。2.不同劑量照射前后食管癌細(xì)胞株Eca109中PD-L1表達(dá)情況2.1 PD-L1在食管癌細(xì)胞株Eca109中的表達(dá)RT-PCR檢測(cè)結(jié)果示,食管癌細(xì)胞株Eca109中PD-L1m RNA的表達(dá)水平(0.45±0.04)明顯高于正常食管細(xì)胞HET-1A(0.25±0.01),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。同時(shí)Western blotting也發(fā)現(xiàn)食管癌細(xì)胞株Eca109 PD-L1蛋白表達(dá)水平明顯高于正常食管細(xì)胞HET-1A,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2.2照射前后食管癌細(xì)胞株Eca109中PD-L1表達(dá)情況與對(duì)照組相比,不同劑量照射食管癌Eca109細(xì)胞之后,PD-L1在m RNA和蛋白水平均明顯增加(P0.05),且隨照射劑量增加而增加,均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在3Gy照射后12h表達(dá)量達(dá)到峰值,而6Gy、9Gy照射后24h表達(dá)量達(dá)到峰值,隨照射后時(shí)間延長(zhǎng),PD-L1表達(dá)量逐漸下降。2.3照射前后食管癌細(xì)胞株Eca109的增殖能力CCK8檢測(cè)結(jié)果示,與未照射組相比,不同劑量照射組食管癌細(xì)胞的增殖水平在照射后不同時(shí)間點(diǎn)均下降(P0.05),其中24h下降最為顯著。3.RNAi技術(shù)調(diào)控PD-L1表達(dá)后對(duì)食管癌細(xì)胞株Eca109的影響3.1轉(zhuǎn)染后食管癌細(xì)胞株Eca109中PD-L1表達(dá)RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,Eca109-P組細(xì)胞中PD-L1 m RNA表達(dá)較Eca109組和Eca109-N組分別下降了72.5%(1.02±0.03)和71.7%(0.99±0.03)(P0.05),而Eca109-N組相比于Eca109組下降了3%(P0.05),無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.2轉(zhuǎn)染后對(duì)照射前后食管癌細(xì)胞增殖水平的影響轉(zhuǎn)染后36h內(nèi)各組細(xì)胞增殖水平無明顯差異(P0.05),36h時(shí)轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖水平低于Eca109組和Eca109-N組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。經(jīng)6Gy照射后,各組細(xì)胞的增殖水平在照射后24h均下降(P0.05),隨著照射后時(shí)間延長(zhǎng),各組細(xì)胞的增殖水平逐漸增加,但Eca109-P組在36h、48h的增殖活力明顯低于Eca109組和Eca109-N組(P0.05)。3.3 PD-L1下調(diào)后對(duì)照射前后食管癌細(xì)胞周期的影響未照射Eca109組、Eca109-N組的細(xì)胞處于G0/G1期、G2/M期和S期比例未見明顯差異(P0.05),Eca109-P組G2/M期比例下降,S期比例上升(P0.05)。經(jīng)6Gy照射后各組細(xì)胞處于G0/G1期比例明顯低于相應(yīng)未照射組(P0.05)。同時(shí)也觀察到,照射后的各組細(xì)胞處于G2/M期比例高于相應(yīng)未照射組(P0.05),且照射后Eca109-P組細(xì)胞處于G0/G1期的比例明顯高于Eca109組和Eca109-N組(P0.05)。照射后的各組細(xì)胞處于S期比例未見明顯明顯變化。3.4轉(zhuǎn)染后對(duì)照射前后食管癌細(xì)胞凋亡的影響轉(zhuǎn)染后Eca109-P組細(xì)胞凋亡率高于Eca109組和Eca109-N組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。經(jīng)6Gy照射后各組細(xì)胞凋亡率明顯高于未照射組(P0.05),且照射后Eca109-P組細(xì)胞凋亡率明顯高于Eca109組和Eca109-N組(P0.05)。結(jié)論:1.PD-L1在食管鱗癌組織中表達(dá)明顯高于正常食管粘膜組織。PD-L1不能作為預(yù)測(cè)食管癌放療患者預(yù)后的指標(biāo),可作為預(yù)測(cè)食管癌轉(zhuǎn)移潛能和放射敏感性的生物標(biāo)記物。2.食管癌Eca109細(xì)胞中PD-L1表達(dá)高于正常食管癌細(xì)胞,且PD-L1表達(dá)量隨放射劑量增加而增加,存在時(shí)間劑量依賴性。3.RNAi技術(shù)沉默食管癌細(xì)胞中PD-L1表達(dá)后,細(xì)胞增殖能力下降,誘導(dǎo)細(xì)胞G0/G1期阻滯,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,提示PD-L1可促進(jìn)食管癌Eca109細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)G0/G1期向G2/M期轉(zhuǎn)化,增加增殖期細(xì)胞比例,從而增加對(duì)放射線的敏感性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：川北醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R735.1

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