【摘要】：micro RNA(以下簡(jiǎn)稱mi RNA)是一類長(zhǎng)度為19~25個(gè)核苷酸的內(nèi)源非編碼小分子RNA,它通過(guò)與靶基因m RNA的3‘-非編碼區(qū)(3‘-untranslated region,3’-UTR)特異結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后水平導(dǎo)致基因沉默。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)mi RNA在腫瘤中發(fā)揮“促癌”和“抑癌”的作用而影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后。闡明mi RNA的功能及具體作用機(jī)制,并將它們整合到整個(gè)表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中是近幾年來(lái)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。我國(guó)每年胃癌新發(fā)病例約40萬(wàn)例,是我國(guó)最常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一。目前唯一證實(shí)的可能治愈胃癌的手段就是手術(shù)治療,但是仍有部分患者在術(shù)后轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā),因此控制胃癌的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移及晚期胃癌患者的綜合性治療都需要化療的手段來(lái)協(xié)助實(shí)現(xiàn)。然而化療過(guò)程中的關(guān)鍵棘手的問(wèn)題就是耐藥的出現(xiàn)。因此尋找高效靈敏的分子標(biāo)志物、闡明胃癌多藥耐藥的分子機(jī)制、并探索逆轉(zhuǎn)耐藥的藥物靶點(diǎn)成為腫瘤研究領(lǐng)域的一個(gè)重要方向。近幾年發(fā)現(xiàn)mi RNA在胃癌的發(fā)生發(fā)展及多藥耐藥過(guò)程中也起著重要的作用。mi R-21是目前發(fā)現(xiàn)的唯一一個(gè)在多種惡性腫瘤中都表現(xiàn)出“癌基因”特性的mi RNA,抑制其表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡并抑制腫瘤細(xì)胞的惡性增殖。已有研究表明,mi R-21與胰腺癌、膽管細(xì)胞癌、乳腺癌等惡性腫瘤的耐藥相關(guān),但是mi R-21與胃癌化療耐藥的相關(guān)研究還少見(jiàn)報(bào)道。為進(jìn)一步探索mi R-21在胃癌耐藥方面的功能及調(diào)控機(jī)制,我們對(duì)mi R-21在胃癌的表達(dá)、介導(dǎo)耐藥中的功能以及其下游的靶基因進(jìn)行了研究,以期為臨床上胃癌化療耐藥的研究提供新的靶點(diǎn)。簡(jiǎn)述如下。目的:探討mi R-21在胃癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)差異,并明確其表達(dá)與胃癌臨床病理參數(shù)及預(yù)后的相關(guān)性;研究mi R-21在胃癌耐藥細(xì)胞中的作用和調(diào)控機(jī)制。方法:(1)收集以下標(biāo)本和隨訪資料(46例初發(fā)胃癌患者手術(shù)切除標(biāo)本及其癌旁組織),QRT-PCR檢測(cè)mi R-21在胃癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá), Mann-Whitney U檢驗(yàn)和one-way ANOVA的統(tǒng)計(jì)方法研究miR-21的表達(dá)水平與胃癌各項(xiàng)臨床特征及預(yù)后的相關(guān)性。(2)采用濃度梯度遞增法和間歇誘導(dǎo)法成功建立誘導(dǎo)建立胃癌阿霉素耐藥細(xì)胞株SGC7901/DOX3,在此基礎(chǔ)上,檢測(cè)耐藥細(xì)胞SGC7901/DOX3與親本細(xì)胞株SGC7901中mi R-21的表達(dá)。利用脂質(zhì)體Lipofectamine 3000將成熟mi R-21的模擬物mimics(mi R-21)、阻遏物inhibitors(anti-mi R-21)及相應(yīng)的陰性對(duì)照negative control RNA(mi R-NC和anti-mi R-NC)轉(zhuǎn)染至SGC7901和SGC7901/DDP細(xì)胞;real-time PCR技術(shù)驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率;CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖水平;AnnexinⅤ/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)和Western Blot檢測(cè)細(xì)胞凋亡率;PI流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期。(3)靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)和篩選采用多個(gè)應(yīng)用生物信息學(xué)軟件進(jìn)行,靶基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證采用雙熒光素酶報(bào)告法和Western Blot完成。并在臨床樣本中驗(yàn)證所篩選出的靶基因的表達(dá),分析其與mi R-21的相關(guān)性。(4)定量PCR和Western blot法分別檢測(cè)SGC7901/DOX3與SGC7901細(xì)胞間PTEN和TIMP3 m RNA和蛋白表達(dá)差異,CCK-8法、AnnexinⅤ/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)和Western Blot分別檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染干擾PTEN和TIMP3對(duì)胃癌細(xì)胞增殖凋亡的影響。結(jié)果:(1)mi R-21在初發(fā)和復(fù)發(fā)的胃癌患者癌組織中的表達(dá)水平均顯著高于相應(yīng)的癌旁正常組織(P0.05),且復(fù)發(fā)的胃癌患者癌組織中比初發(fā)患者中更高(P0.05)。臨床病理特征研究發(fā)現(xiàn),mi R-21與胃癌組織分化程度(P=0.017)、臨床分期(P=0.047)及是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.013)等臨床特征有關(guān)。(2)與SGC7901細(xì)胞相比,mi R-21在SGC7901/DOX3中表達(dá)增高8.5±0.887倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。而且隨著耐藥濃度的提高mi R-21的表達(dá)逐步上升,暗示了mi R-21表達(dá)可能與胃癌細(xì)胞耐藥相關(guān)。在SGC7901/DOX3中轉(zhuǎn)染anti-mi R-21能逆轉(zhuǎn)其對(duì)阿霉素的耐藥性。anti-mi R-21組對(duì)阿霉素的IC50為4.476±0.014μg/m L,與anti-mi R-NC組(23.085±0.0639μg/m L)相比,有顯著性差異(P0.01)。而且,SGC7901/DOX3細(xì)胞轉(zhuǎn)染anti-mi R-21和anti-mi R-NC 24h后加入終濃度為5.0μg/m L阿霉素培養(yǎng)48h后,anti-mi R-21組的凋亡率明顯增加。同樣,在SGC7901中轉(zhuǎn)染mi R-21后能明顯增加敏感株對(duì)阿霉素的耐藥性。mi R-21組對(duì)阿霉素的IC50為9.236±0.024μg/m L,與mi R-NC組(0.775±0.074μg/m L)相比,有顯著性差異(P0.01)。SGC7901細(xì)胞轉(zhuǎn)染mi R-21mimics或mi R-NC 24h后加入終濃度為0.8μg/m L阿霉素培養(yǎng)48h后,過(guò)表達(dá)mi R-21組凋亡率明顯減少,與NC組相比有明顯差異(P0.05)。(3)軟件預(yù)測(cè)和雙熒光報(bào)告實(shí)驗(yàn)篩選出mi R-21在胃癌細(xì)胞中的靶基因-PTEN和TIMP3。SGC7901細(xì)胞轉(zhuǎn)染mi R-21mimics后,PTEN和TIMP3的m RNA和蛋白均降低。SGC7901/DOX3細(xì)胞轉(zhuǎn)染anti-mi R-21后,其細(xì)胞內(nèi)PTEN和TIMP3的m RNA和蛋白的表達(dá)較親本細(xì)胞SGC7901明顯更高。在胃癌組織中,PTEN和TIMP3與mi R-21的水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。(4)SGC7901/DOX3細(xì)胞系中PTEN和TIMP3的m RNA和蛋白的表達(dá)較親本細(xì)胞SGC7901明顯減低(P0.01)。在SGC7901中轉(zhuǎn)染si-PTEN或si-TIMP3后能增強(qiáng)其對(duì)阿霉素的耐藥性。si-PTEN和si-TIMP3組對(duì)阿霉素的IC50分別為20.22±0.039μg/m L、18.51±0.056μg/m L,與si-NC組(4.49±0.032μg/m L)相比,有顯著性差異(P0.01)。結(jié)論:本論文的研究工作檢測(cè)了mi R-21、PTEN及TIMP3在胃癌患者中的表達(dá)水平,闡明了高表達(dá)mi R-21與臨床特征及預(yù)后相關(guān)性,揭示了mi R-21參與胃癌耐藥的新機(jī)制,證明了高表達(dá)mi R-21能夠通過(guò)靶向PTEN及TIMP3而改變細(xì)胞周期時(shí)相,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,致使細(xì)胞的耐藥性改變。研究結(jié)果為胃癌的基因靶向治療提供了新的依據(jù),也為小分子藥物的研究奠定了基礎(chǔ),對(duì)于胃癌的臨床治療具有重要的理論意義及潛在的應(yīng)用價(jià)值。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.2

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本文編號(hào)：2268061