【摘要】：目的:以WT1基因陽性的患者為研究對(duì)象,提取其外周血單個(gè)核細(xì)胞,體外誘導(dǎo)產(chǎn)生樹突狀細(xì)胞(DC),負(fù)載WT1復(fù)合抗原肽,體外誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK),檢測(cè)DC細(xì)胞與CIK細(xì)胞的增殖能力、免疫表型變化,并檢測(cè)DC-CIK混合培養(yǎng)后對(duì)WT1基因陽性K562細(xì)胞的殺傷作用,探索收獲WT1抗原特異性效應(yīng)細(xì)胞的合理途徑。方法:DC細(xì)胞的培養(yǎng):抽取WT1陽性白血病患者經(jīng)肝素抗凝后的外周血,經(jīng)肝素抗凝后,用淋巴細(xì)胞分離液分離獲得單個(gè)核細(xì)胞(MNC,mononuclear cells)。然后用RPMI 1640培養(yǎng)液將細(xì)胞濃度調(diào)整至5×106/ml,孵育4小時(shí)后,提取貼壁細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106/ml加入6孔培養(yǎng)板中,并加入細(xì)胞因子,使得重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rh GM-CSF)濃度為1000U/ml、重組人白細(xì)胞介素-4(rh IL-4)濃度為1000 U/ml。第5天加入WTI混合抗原肽50ng/ml,實(shí)驗(yàn)組DC細(xì)胞負(fù)載WTI混合抗原肽,對(duì)照組DC細(xì)胞不負(fù)載WT1抗原肽,第6天,兩組加重組人腫瘤壞死因子-a(rh TNF-a),使?jié)舛葹?000U/ml,促進(jìn)DC細(xì)胞成熟。CIK細(xì)胞的體外培養(yǎng):同上來源的細(xì)胞經(jīng)過單個(gè)核細(xì)胞的分離,孵育4小時(shí)后,收集懸浮的細(xì)胞,將細(xì)胞濃度調(diào)整至1×106/ml,加入干擾素-γ(Interferon-γ,IFN-γ)1000U/ml,24小時(shí)后加入CD-3單抗(CD-3 monoclonal antibody)50ng/ml,重組人白細(xì)胞介素-2(rh-interleukin-2,rh IL-2)500U/ml,以后隔日更換新的培養(yǎng)液并計(jì)數(shù),同時(shí)補(bǔ)充加入rh IL-2。培育第7天,用臺(tái)盼藍(lán)排斥法染色DC細(xì)胞和CIK細(xì)胞,計(jì)數(shù)活細(xì)胞,用完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清的RPMI1640液)調(diào)整DC細(xì)胞濃度為1×106/ml,CIK細(xì)胞濃度為5×106/ml,按照l:5比例混合,繼續(xù)培養(yǎng),在共培養(yǎng)的第1天、第3天、第7天收集共培養(yǎng)細(xì)胞,計(jì)數(shù),應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其免疫分子標(biāo)記,并檢測(cè)其對(duì)靶細(xì)胞的殺傷活性。結(jié)果:1負(fù)載WT1抗原肽組與未負(fù)載WT1抗原肽組來源的DC-CIK細(xì)胞增殖能力的比較在溫箱中孵育過的貼壁單個(gè)核細(xì)胞,經(jīng)過GM-CSF和IL-4誘導(dǎo)后成樹突狀細(xì)胞,倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),培育中細(xì)胞外形發(fā)生變化,細(xì)胞量亦有增加。培育48小時(shí)后細(xì)胞體積較前增大,表面有毛刺樣突起,隨著培育時(shí)間的增長(zhǎng),細(xì)胞體積明顯增大,細(xì)胞邊緣毛刺樣突起增多,變長(zhǎng)(見Fig.1)。懸浮單個(gè)核細(xì)胞在相應(yīng)細(xì)胞因子的誘導(dǎo)下擴(kuò)增成CIK細(xì)胞,并逐漸形成細(xì)胞團(tuán);CIK細(xì)胞最初,散在均勻分布,個(gè)小,亮而圓(見Fig.2)。在培養(yǎng)的第3天,細(xì)胞形態(tài)開始呈現(xiàn)出不規(guī)則變化,并呈細(xì)胞團(tuán)樣生長(zhǎng)(見Fig.3)。從培養(yǎng)的第6天起,細(xì)胞明顯增殖,成叢或以集落狀態(tài)生長(zhǎng),并懸浮于培養(yǎng)基中(見Fig.4)。隨著培養(yǎng)時(shí)間增長(zhǎng),細(xì)胞集落數(shù)逐漸增多。經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)排斥法對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),第7天,負(fù)載WT1抗原肽組DC-CIK細(xì)胞的增殖倍數(shù)為(10.01±0.71)倍,未負(fù)載WT1抗原肽組DC-CIK增生了(10.20±0.60)倍;第14天,負(fù)載WT1抗原肽組DC-CIK細(xì)胞數(shù)為原來的(17.16±0.93)倍,未負(fù)載WT1抗原肽組是原來的(17.40±0.94)倍(見Table 1)。分析比較同一組細(xì)胞的增殖倍數(shù)隨時(shí)間的增加均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但兩組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,以上結(jié)果說明,是否負(fù)荷腫瘤抗原肽對(duì)DC-CIK的增殖沒有顯著影響。2負(fù)載WT1抗原肽組與未負(fù)載WT1抗原肽組的DC-CIK分子免疫表型的變化分別收集培養(yǎng)第1天、7天及14天的兩組培養(yǎng)細(xì)胞,通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞分子免疫表型的變化。結(jié)果顯示:當(dāng)天測(cè)得白血病患者細(xì)胞的分子免疫表型結(jié)果如下:CD3+CD8+細(xì)胞為(30.34±3.14)%,CD3+CD56+細(xì)胞為(5.49±0.45)%。細(xì)胞培養(yǎng)的第7天、14天免疫表型檢測(cè)結(jié)果如下:負(fù)載WT1抗原肽組CD3+CD8+細(xì)胞為(40.25±2.66)%,(76.48±4.08)%,CD3+CD56+細(xì)胞為(9.48±1.06)%,(29.11±4.27)%;未WT1負(fù)載抗原肽組CD3+CD8+細(xì)胞為(39.61±2.51)%,(75.61±6.27)%,CD3+CD56+細(xì)胞為(9.44±1.10)%,(29.11±4.91)%(見Table 2),在DC-CIK細(xì)胞的培養(yǎng)過程中,隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng),負(fù)載WT1抗原肽組與未負(fù)載WT1抗原肽組來源DC-CIK細(xì)胞,其CD3+CD8+及CD3+CD56+雙陽性細(xì)胞比例均有顯著提高,但兩組無顯著性差異,即P0.05,以上數(shù)據(jù)說明是否負(fù)荷抗原肽對(duì)誘導(dǎo)出的DC-CIK細(xì)胞的表型沒有影響。3負(fù)載WT1抗原肽組與未負(fù)載WT1抗原肽組來源DC-CIK細(xì)胞殺傷活性比較采集培養(yǎng)14天的DC-CIK細(xì)胞做殺傷實(shí)驗(yàn),收集培養(yǎng)的負(fù)載WT1抗原肽組DC-CIK細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞,分別以WT1基因(+)的K562細(xì)胞和WT1基因(-)的HL60細(xì)胞為靶細(xì)胞,在效靶比5:1~20:1范圍內(nèi),比較兩者的殺傷活性。負(fù)載WT1抗原肽組DC-CIK在效靶比分別為5:1,10:1,20:1時(shí)對(duì)K562細(xì)胞的殺傷活性結(jié)果為(49.21±4.78)%,(74.86±1.55)%,(83.01±2.35)%,同時(shí)檢測(cè)在相應(yīng)效靶比下,對(duì)HL60細(xì)胞的殺傷為(39.18±1.96)%,(60.44±2.79)%,(69.56±1.45)%(見Table 3),經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,相同效靶比條件下二者的殺傷力有顯著性差異。收集培養(yǎng)的未負(fù)載WT1抗原肽組DC-CIK細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞,分別以WT1基因(+)的K562細(xì)胞和WT1基因(-)的HL60細(xì)胞為靶細(xì)胞,在效靶比5:1~20:1范圍內(nèi),比較兩者的殺傷活性。負(fù)載WT1抗原肽組DC-CIK在效靶比分別為5:1,10:1,20:1時(shí)對(duì)K562細(xì)胞的殺傷活性結(jié)果為(38.95±2.03)%,(59.48±3.97)%,(69.19±1.52)%,同時(shí)檢測(cè)在相應(yīng)效靶比下,對(duì)HL60細(xì)胞的殺傷為(39.95±1.45)%,(60.88±1.30)%,(70.08±1.07)%(見Table 4),經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,相同效靶比條件下二者的殺傷力無差異。以上數(shù)據(jù)說明負(fù)載WT1抗原肽組和未負(fù)載WT1抗原肽組來源DC-CIK細(xì)胞對(duì)WT1基因(-)的HL60細(xì)胞均有殺傷作用,兩組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩組對(duì)WT1(+)的K562細(xì)胞的殺傷,負(fù)載WT1抗原肽組明顯強(qiáng)于未負(fù)載WT1抗原肽組,兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說明負(fù)載WT1抗原肽組來源的DC-CIK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷。結(jié)論:1應(yīng)用白血病患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞通過負(fù)荷抗原的的培養(yǎng)方法可培養(yǎng)出DC-CIK細(xì)胞,且具有殺傷活性。2負(fù)載WT1抗原肽組與未負(fù)載WT1抗原肽組來源DC-CIK細(xì)胞,其CD3+CD8+及CD3+CD56+雙陽性細(xì)胞比例均有顯著提高,兩組無顯著性差異。3負(fù)載WT1抗原肽組和未負(fù)載WT1抗原肽組來源DC-CIK細(xì)胞對(duì)WT1基因(-)的HL60細(xì)胞均有殺傷作用,兩組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4兩組對(duì)WT1(+)的K562細(xì)胞的殺傷,負(fù)載WT1抗原肽組明顯強(qiáng)于未負(fù)載WT1抗原肽組,兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說明負(fù)載WT1抗原肽組來源的DC-CIK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷。
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【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R733.7

【參考文獻(xiàn)】

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1 任歡,邢淑賢,徐紅薇,宋英暉,商曉舟,周貴生,田景先,李殿俊;CIK的體外增殖及體內(nèi)外殺瘤活性的實(shí)驗(yàn)研究[J];中國(guó)腫瘤生物治療雜志;1999年01期

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本文編號(hào)：2265581