【摘要】：目的:以WT1基因陽性的患者為研究對象,提取其外周血單個核細胞,體外誘導產(chǎn)生樹突狀細胞(DC),負載WT1復(fù)合抗原肽,體外誘導產(chǎn)生細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK),檢測DC細胞與CIK細胞的增殖能力、免疫表型變化,并檢測DC-CIK混合培養(yǎng)后對WT1基因陽性K562細胞的殺傷作用,探索收獲WT1抗原特異性效應(yīng)細胞的合理途徑。方法:DC細胞的培養(yǎng):抽取WT1陽性白血病患者經(jīng)肝素抗凝后的外周血,經(jīng)肝素抗凝后,用淋巴細胞分離液分離獲得單個核細胞(MNC,mononuclear cells)。然后用RPMI 1640培養(yǎng)液將細胞濃度調(diào)整至5×106/ml,孵育4小時后,提取貼壁細胞,調(diào)整細胞濃度為5×106/ml加入6孔培養(yǎng)板中,并加入細胞因子,使得重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(rh GM-CSF)濃度為1000U/ml、重組人白細胞介素-4(rh IL-4)濃度為1000 U/ml。第5天加入WTI混合抗原肽50ng/ml,實驗組DC細胞負載WTI混合抗原肽,對照組DC細胞不負載WT1抗原肽,第6天,兩組加重組人腫瘤壞死因子-a(rh TNF-a),使?jié)舛葹?000U/ml,促進DC細胞成熟。CIK細胞的體外培養(yǎng):同上來源的細胞經(jīng)過單個核細胞的分離,孵育4小時后,收集懸浮的細胞,將細胞濃度調(diào)整至1×106/ml,加入干擾素-γ(Interferon-γ,IFN-γ)1000U/ml,24小時后加入CD-3單抗(CD-3 monoclonal antibody)50ng/ml,重組人白細胞介素-2(rh-interleukin-2,rh IL-2)500U/ml,以后隔日更換新的培養(yǎng)液并計數(shù),同時補充加入rh IL-2。培育第7天,用臺盼藍排斥法染色DC細胞和CIK細胞,計數(shù)活細胞,用完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清的RPMI1640液)調(diào)整DC細胞濃度為1×106/ml,CIK細胞濃度為5×106/ml,按照l:5比例混合,繼續(xù)培養(yǎng),在共培養(yǎng)的第1天、第3天、第7天收集共培養(yǎng)細胞,計數(shù),應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測其免疫分子標記,并檢測其對靶細胞的殺傷活性。結(jié)果:1負載WT1抗原肽組與未負載WT1抗原肽組來源的DC-CIK細胞增殖能力的比較在溫箱中孵育過的貼壁單個核細胞,經(jīng)過GM-CSF和IL-4誘導后成樹突狀細胞,倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài),培育中細胞外形發(fā)生變化,細胞量亦有增加。培育48小時后細胞體積較前增大,表面有毛刺樣突起,隨著培育時間的增長,細胞體積明顯增大,細胞邊緣毛刺樣突起增多,變長(見Fig.1)。懸浮單個核細胞在相應(yīng)細胞因子的誘導下擴增成CIK細胞,并逐漸形成細胞團;CIK細胞最初,散在均勻分布,個小,亮而圓(見Fig.2)。在培養(yǎng)的第3天,細胞形態(tài)開始呈現(xiàn)出不規(guī)則變化,并呈細胞團樣生長(見Fig.3)。從培養(yǎng)的第6天起,細胞明顯增殖,成叢或以集落狀態(tài)生長,并懸浮于培養(yǎng)基中(見Fig.4)。隨著培養(yǎng)時間增長,細胞集落數(shù)逐漸增多。經(jīng)臺盼藍排斥法對活細胞進行計數(shù),第7天,負載WT1抗原肽組DC-CIK細胞的增殖倍數(shù)為(10.01±0.71)倍,未負載WT1抗原肽組DC-CIK增生了(10.20±0.60)倍;第14天,負載WT1抗原肽組DC-CIK細胞數(shù)為原來的(17.16±0.93)倍,未負載WT1抗原肽組是原來的(17.40±0.94)倍(見Table 1)。分析比較同一組細胞的增殖倍數(shù)隨時間的增加均有統(tǒng)計學意義,但兩組之間沒有統(tǒng)計學差異,以上結(jié)果說明,是否負荷腫瘤抗原肽對DC-CIK的增殖沒有顯著影響。2負載WT1抗原肽組與未負載WT1抗原肽組的DC-CIK分子免疫表型的變化分別收集培養(yǎng)第1天、7天及14天的兩組培養(yǎng)細胞,通過流式細胞儀檢測細胞分子免疫表型的變化。結(jié)果顯示:當天測得白血病患者細胞的分子免疫表型結(jié)果如下:CD3+CD8+細胞為(30.34±3.14)%,CD3+CD56+細胞為(5.49±0.45)%。細胞培養(yǎng)的第7天、14天免疫表型檢測結(jié)果如下:負載WT1抗原肽組CD3+CD8+細胞為(40.25±2.66)%,(76.48±4.08)%,CD3+CD56+細胞為(9.48±1.06)%,(29.11±4.27)%;未WT1負載抗原肽組CD3+CD8+細胞為(39.61±2.51)%,(75.61±6.27)%,CD3+CD56+細胞為(9.44±1.10)%,(29.11±4.91)%(見Table 2),在DC-CIK細胞的培養(yǎng)過程中,隨著培養(yǎng)時間的增長,負載WT1抗原肽組與未負載WT1抗原肽組來源DC-CIK細胞,其CD3+CD8+及CD3+CD56+雙陽性細胞比例均有顯著提高,但兩組無顯著性差異,即P0.05,以上數(shù)據(jù)說明是否負荷抗原肽對誘導出的DC-CIK細胞的表型沒有影響。3負載WT1抗原肽組與未負載WT1抗原肽組來源DC-CIK細胞殺傷活性比較采集培養(yǎng)14天的DC-CIK細胞做殺傷實驗,收集培養(yǎng)的負載WT1抗原肽組DC-CIK細胞作為效應(yīng)細胞,分別以WT1基因(+)的K562細胞和WT1基因(-)的HL60細胞為靶細胞,在效靶比5:1~20:1范圍內(nèi),比較兩者的殺傷活性。負載WT1抗原肽組DC-CIK在效靶比分別為5:1,10:1,20:1時對K562細胞的殺傷活性結(jié)果為(49.21±4.78)%,(74.86±1.55)%,(83.01±2.35)%,同時檢測在相應(yīng)效靶比下,對HL60細胞的殺傷為(39.18±1.96)%,(60.44±2.79)%,(69.56±1.45)%(見Table 3),經(jīng)過統(tǒng)計學分析,相同效靶比條件下二者的殺傷力有顯著性差異。收集培養(yǎng)的未負載WT1抗原肽組DC-CIK細胞作為效應(yīng)細胞,分別以WT1基因(+)的K562細胞和WT1基因(-)的HL60細胞為靶細胞,在效靶比5:1~20:1范圍內(nèi),比較兩者的殺傷活性。負載WT1抗原肽組DC-CIK在效靶比分別為5:1,10:1,20:1時對K562細胞的殺傷活性結(jié)果為(38.95±2.03)%,(59.48±3.97)%,(69.19±1.52)%,同時檢測在相應(yīng)效靶比下,對HL60細胞的殺傷為(39.95±1.45)%,(60.88±1.30)%,(70.08±1.07)%(見Table 4),經(jīng)過統(tǒng)計學分析,相同效靶比條件下二者的殺傷力無差異。以上數(shù)據(jù)說明負載WT1抗原肽組和未負載WT1抗原肽組來源DC-CIK細胞對WT1基因(-)的HL60細胞均有殺傷作用,兩組無統(tǒng)計學意義。兩組對WT1(+)的K562細胞的殺傷,負載WT1抗原肽組明顯強于未負載WT1抗原肽組,兩組差異有統(tǒng)計學意義,說明負載WT1抗原肽組來源的DC-CIK細胞對腫瘤細胞的特異性殺傷。結(jié)論:1應(yīng)用白血病患者的外周血單個核細胞通過負荷抗原的的培養(yǎng)方法可培養(yǎng)出DC-CIK細胞,且具有殺傷活性。2負載WT1抗原肽組與未負載WT1抗原肽組來源DC-CIK細胞,其CD3+CD8+及CD3+CD56+雙陽性細胞比例均有顯著提高,兩組無顯著性差異。3負載WT1抗原肽組和未負載WT1抗原肽組來源DC-CIK細胞對WT1基因(-)的HL60細胞均有殺傷作用,兩組無統(tǒng)計學意義。4兩組對WT1(+)的K562細胞的殺傷,負載WT1抗原肽組明顯強于未負載WT1抗原肽組,兩組差異有統(tǒng)計學意義,說明負載WT1抗原肽組來源的DC-CIK細胞對腫瘤細胞的特異性殺傷。
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【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R733.7

【參考文獻】

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1 任歡,邢淑賢,徐紅薇,宋英暉,商曉舟,周貴生,田景先,李殿俊;CIK的體外增殖及體內(nèi)外殺瘤活性的實驗研究[J];中國腫瘤生物治療雜志;1999年01期

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本文編號：2265581