【摘要】：CD82是抑癌基因KAI1編碼的細(xì)胞膜糖蛋白,屬于四跨膜蛋白超家族(transmembrane 4 superfamily or tetraspan superfamily,TM4SF)成員之一,其主要生物學(xué)功能是參與細(xì)胞的聚集、粘附、遷移等。CD82在正常機(jī)體組織廣泛表達(dá),在腫瘤組織表達(dá)下降。大量研究結(jié)果表明,CD82可抑制多種組織來源的腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移,是廣譜的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制因子。CD82抑制腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究日益受到重視,但其詳細(xì)分子機(jī)理仍不完全清楚。CD82由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)三部分組成,跨膜區(qū)為四個(gè)疏水的肽段,胞外區(qū)形成一個(gè)小環(huán)(small extracellular loop,SEL)和一個(gè)大環(huán)(large extracellular loop,LEL),胞內(nèi)區(qū)包括N-端、C-端和一個(gè)細(xì)胞內(nèi)環(huán)。分子結(jié)構(gòu)是蛋白發(fā)揮功能的基礎(chǔ),胞外區(qū)結(jié)構(gòu)域是CD82直接與細(xì)胞外基質(zhì)分子及其它細(xì)胞相互識(shí)別、結(jié)合及相互作用的部位,是CD82發(fā)揮生理功能的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。對(duì)CD82蛋白胞外區(qū)結(jié)構(gòu)域功能進(jìn)行研究,可闡明其抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機(jī)理。目前,對(duì)CD82的胞外區(qū)功能研究較少,尤其是胞外區(qū)SEL功能尚不明確。為研究CD82胞外結(jié)構(gòu)域在CD82抑制腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用,本論文采用基因重組技術(shù)和化學(xué)合成方法得到了CD82-LEL序列模擬肽和CD82-SEL序列模擬寡肽,進(jìn)行了以下幾個(gè)內(nèi)容的研究。一、CD82胞外區(qū)序列模擬肽段對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移的影響。CD82抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的主要機(jī)理是抑制細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和遷移能力。采用劃痕法、Boyden小室培養(yǎng)法對(duì)CD82-LEL和CD82-SEL序列模擬肽段體外抑制腫瘤細(xì)胞遷移作用進(jìn)行了觀察。結(jié)果:采用基因重組技術(shù)和化學(xué)合成方法獲得了CD82-LEL序列模擬肽和CD82-SEL序列模擬寡肽。CD82-LEL序列模擬肽對(duì)SW620腫瘤細(xì)胞的體外遷移和侵襲無明顯抑制作用,而CD82-SEL序列模擬寡肽對(duì)SW620腫瘤細(xì)胞的體外遷移和侵襲有抑制作用,處理濃度越大抑制作用越強(qiáng)。結(jié)論:cd82-lel序列模擬肽在體外不能抑制細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和遷移,而cd82-sel序列模擬寡肽抑制體外培養(yǎng)的細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和遷移,隨處理濃度增大抑制作用增強(qiáng)。說明,cd82-sel可能是cd82抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的重要功能結(jié)構(gòu)域。二、cd82胞外區(qū)序列模擬肽段對(duì)腫瘤細(xì)胞與不同細(xì)胞外基質(zhì)分子識(shí)別、粘附的影響。cd82胞外結(jié)構(gòu)域直接參與細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間的識(shí)別、結(jié)合,因此,是cd82參與細(xì)胞遷移、運(yùn)動(dòng)的重要結(jié)構(gòu),也是其腫瘤轉(zhuǎn)移抑制作用的重要功能部位。在這部分,我們觀察了cd82-lel序列模擬肽和cd82-sel序列模擬寡肽對(duì)sw620腫瘤細(xì)胞與層粘連蛋白(laminin,ln)、纖粘連蛋白(fibronectin,fn)、基質(zhì)膠(matrigel)粘附的影響。結(jié)果:cd82-lel序列模擬肽對(duì)sw620腫瘤細(xì)胞與ln、fn、matrigel的粘附無明顯抑制作用,而cd82-sel序列模擬寡肽對(duì)sw620腫瘤細(xì)胞與ln、fn、matrigel的粘附有明顯抑制作用,且其抑制能力與處理濃度呈正相關(guān)。結(jié)論:cd82-lel序列模擬肽不能獨(dú)自參與腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的識(shí)別、粘附,或由失去糖鏈結(jié)構(gòu)而致;cd82-sel序列模擬寡肽具有抑制腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的識(shí)別、粘附作用,這可能與cd82-sel序列模擬寡肽抑制腫瘤細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)有關(guān)。三、cd82-sel序列模擬寡肽影響整合素與細(xì)胞外基質(zhì)分子之間的相互作用。分布于細(xì)胞表面的粘附分子中,只有整合素的配體是細(xì)胞外基質(zhì)分子,包括fn、ln、玻璃粘連蛋白(vitronecin,vn)和膠原蛋白(collagen,ca)等。所以只有整合素才是介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)接觸結(jié)合的粘附分子。有文獻(xiàn)報(bào)道,cd82可抑制整合素與ln的結(jié)合,并發(fā)現(xiàn)cd82在細(xì)胞表面常與整合素、生長因子受體及其他四跨膜家族蛋白結(jié)合成復(fù)合體而發(fā)揮作用。為探討cd82-sel序列模擬寡肽抑制細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和遷移以及抑制細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)粘附的分子機(jī)制,我們對(duì)整合素在cd82-sel序列模擬寡肽抑制腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的識(shí)別、粘附過程中的作用進(jìn)行了初步研究。結(jié)果:(1)采用westernblot技術(shù)檢測(cè)了不同類型整合素亞基在sw620腫瘤細(xì)胞的表達(dá)圖譜。結(jié)果顯示,sw620細(xì)胞可表達(dá)α3、α4、α5、α6、β1、β3亞基。(2)細(xì)胞外基質(zhì)分子ln刺激sw620細(xì)胞整合素α3、α6、β1亞基的表達(dá),FN刺激SW620細(xì)胞整合素α4、α5、β1亞基的表達(dá),Matrigel刺激SW620細(xì)胞整合素α3、β1亞基的表達(dá)。(3)CD82-SEL序列模擬寡肽可分別抑制LN、FN和Matrigel刺激的SW620細(xì)胞整合素α3、α4、α5、α6、β1亞基的表達(dá)。其抑制作用隨處理濃度增加而增強(qiáng)。(4)整合素α3、α6、β1亞基可與LN結(jié)合,α4、α5、β1亞基可與FN結(jié)合,α3、β1亞基可與Matrigel結(jié)合。(5)CD82-SEL序列模擬寡肽抑制整合素亞基與細(xì)胞外基質(zhì)分子LN、FN、Matrigel識(shí)別、結(jié)合。結(jié)論:CD82-SEL序列模擬寡肽既可抑制細(xì)胞外基質(zhì)分子刺激SW620細(xì)胞整合素亞基的表達(dá),又可抑制整合素與細(xì)胞外基質(zhì)分子LN、FN、Matrigel直接結(jié)合。從而抑制細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)分子的識(shí)別粘附。四、CD82-SEL序列模擬寡肽對(duì)SW620細(xì)胞粘著斑激酶酪氨酸殘基磷酸化的影響。粘著斑激酶(FAK)是整合素所介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵蛋白激酶。整合素與其配體結(jié)合以及粘著斑的形成使FAK磷酸化活化,調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、增殖、分裂及遷移運(yùn)動(dòng)。為探討CD82-SEL序列模擬寡肽對(duì)SW620細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、遷移的抑制機(jī)理,我們進(jìn)一步觀察了CD82-SEL序列模擬寡肽對(duì)SW620細(xì)胞FAK酪氨酸殘基磷酸化的影響。結(jié)果:(1)采用Western Blot技術(shù)檢測(cè)了SW620腫瘤細(xì)胞FAK各位點(diǎn)酪氨酸殘基磷酸化情況。結(jié)果顯示,SW620細(xì)胞FAK的397、407、576、577、861、925位酪氨酸殘基均發(fā)生磷酸化。(2)細(xì)胞外基質(zhì)分子LN、FN、Matrigel可刺激SW620細(xì)胞FAK的397、407和861位酪氨酸殘基磷酸化,不影響FAK的925位酪氨酸殘基磷酸化。(3)CD82-SEL序列模擬寡肽抑制細(xì)胞外基質(zhì)分子LN、FN、Matrigel對(duì)SW620細(xì)胞FAK的397、407和861位酪氨酸殘基磷酸化的刺激作用。結(jié)論:CD82-SEL序列模擬寡肽通過抑制SW620腫瘤細(xì)胞整合素與其細(xì)胞外配體結(jié)合,從而抑制FAK的磷酸化活化�？赡苁瞧湟种颇[瘤細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)的重要機(jī)制之一。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R73-3

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本文編號(hào)：2263587