【摘要】：成纖維生長(zhǎng)因子受體(FGFR)3作為一個(gè)跨膜酪氨酸激酶受體蛋白,在軟骨發(fā)育的各個(gè)階段發(fā)揮著重要作用。多種功能激活性FGFR3突變疾病的患者出現(xiàn)以身材矮小為特征的骨骼發(fā)育不良的臨床表現(xiàn),包括軟骨發(fā)育不全(Achondroplasia,ACH),致死性軟骨發(fā)育不良(thanatophoric dysplasia,TD I/II),季肋發(fā)育不良,嚴(yán)重軟骨發(fā)育不良伴棘皮癥等。相反,功能失活性FGFR3突變會(huì)導(dǎo)致屈曲指,高身材和聽(tīng)力喪失(Camptodactyly,tall stature,scoliosis,and hearing loss,CATSHL)綜合征。因此,FGFR3被認(rèn)為在軟骨發(fā)育中負(fù)性調(diào)控軟骨內(nèi)成骨,特別是影響了軟骨細(xì)胞的增殖能力與分化。然而,目前缺乏關(guān)于FGFR3在其他軟骨相關(guān)疾病中的作用以及相關(guān)機(jī)制的研究。良性軟骨腫瘤,特別是外生型軟骨瘤(又稱(chēng)為骨軟骨瘤)和內(nèi)生型軟骨瘤,是人類(lèi)最常見(jiàn)的原發(fā)性骨腫瘤。大多數(shù)軟骨腫瘤發(fā)生于骨骼發(fā)育期,好發(fā)于生長(zhǎng)板附近,提示軟骨腫瘤細(xì)胞可能來(lái)源于軟骨內(nèi)成骨異常的生長(zhǎng)板。此外,多發(fā)性軟骨腫瘤多見(jiàn)于遺傳性疾病,包括遺傳性多發(fā)性骨軟骨瘤病(Hereditary multiple exostoses,HME,又稱(chēng)為骨干連續(xù)癥),內(nèi)生性軟骨瘤病(Ollier病和Maffucci綜合征)和混合性軟骨瘤病(Metachondromatosis,MC),這些疾病分別是由EXT1/2,PTHR1或/和IDH1/2和PTPN11基因突變所導(dǎo)致。然而,這些基因所編碼的蛋白質(zhì)均直接或間接與FGFR3信號(hào)通路有聯(lián)系。更重要的是,CATSHL家系中部分成員的長(zhǎng)骨也被發(fā)現(xiàn)具有骨軟骨瘤樣的影像學(xué)改變。這些證據(jù)均提示FGFR3信號(hào)可能參與了軟骨腫瘤的發(fā)生。然而,FGFR3信號(hào)在軟骨腫瘤發(fā)生中的直接作用與相關(guān)作用機(jī)制目前還不清楚。軟骨細(xì)胞的終末分化,即軟骨肥大化(Hypertrophy),在成年期骨性關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis,OA)的發(fā)生中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。通過(guò)不同途徑抑制關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的肥大化能顯著延緩OA的發(fā)病進(jìn)程。我們前期研究發(fā)現(xiàn),表達(dá)于生長(zhǎng)板軟骨增殖帶和肥大前帶的FGFR3能顯著抑制軟骨細(xì)胞的終末分化。人的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中也表達(dá)FGFR3,并隨著OA的發(fā)生和發(fā)展,FGFR3的表達(dá)逐漸降低。這些證據(jù)均提示,FGFR3不僅參與早期軟骨發(fā)育,還可能影響成年期關(guān)節(jié)軟骨的穩(wěn)態(tài)維持。鑒于FGFR3具有抑制軟骨細(xì)胞肥大化的作用,我們推測(cè)FGFR3能保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨免于退變,并利用基因工程小鼠在關(guān)節(jié)進(jìn)行了相關(guān)研究加以證明�；谇捌谘芯拷Y(jié)果,fgfr3能通過(guò)抑制軟骨細(xì)胞肥大化來(lái)保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨,我們推測(cè)激活fgfr3信號(hào)通路可能是一種治療o(wú)a的有效途徑。fgf9作為fgfr3相對(duì)特異的結(jié)合配體,它能特異性激活軟骨細(xì)胞的fgfr3信號(hào)通路。創(chuàng)傷后骨性關(guān)節(jié)炎(post-traumaticosteoarthritis,ptoa)是臨床上常見(jiàn)的一種oa類(lèi)型。通過(guò)在小鼠ptoa模型的關(guān)節(jié)腔內(nèi)連續(xù)局部注射外源性fgf9,我們發(fā)現(xiàn)其能顯著的保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨免于退變,然而卻促進(jìn)了關(guān)節(jié)周?chē)琴樀纳�。研究方法第一部�?1.青年期可誘導(dǎo)條件性敲除軟骨細(xì)胞的fgfr3:4周齡的同窩fgfr3f/f(cre-negative)及fgfr3f/f;col2a1-creert2(fgfr3cko)小鼠,同時(shí)給予1mg/10g/天他莫昔芬(tm)腹腔內(nèi)注射2次/周直至取材;2.測(cè)量小鼠的身長(zhǎng)及后肢(股骨及脛骨)的長(zhǎng)度,通過(guò)x-ray攝像和micro-ct掃描重建,觀察小鼠大體形態(tài)及骨骼系統(tǒng)的變化情況,通過(guò)蘇木精/伊紅染色法和藏紅固綠染色法觀察小鼠生長(zhǎng)板及軟骨腫瘤的組織學(xué)結(jié)構(gòu),通過(guò)免疫組織化學(xué)染色法研究小鼠生長(zhǎng)板及軟骨腫瘤中pcna,ki67,collagenx,mmp13,ihh和p-erk的表達(dá)情況,通過(guò)tunnl檢測(cè)法研究小鼠生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞凋亡情況;3.利用出生后3-4天的cre-negative和fgfr3cko小鼠膝部的原代軟骨細(xì)胞,研究fgfr3敲除對(duì)軟骨相關(guān)基因col10,mmp13,adamts5,spp1,ihh和pthrp的表達(dá),蛋白質(zhì)erk1/2和p-erk1/2的表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響;4.全身注射ihh信號(hào)阻斷劑(gdc0449,smoi):4周齡的同窩fgfr3f/f(cre-negative)及fgfr3f/f;col2a1-creert2(fgfr3cko)小鼠,隨機(jī)分別分為cre-negative+溶劑組,cre-negative+smoi組,fgfr3cko+溶劑組和fgfr3cko+smoi組。cre-negative+smoi組與fgfr3cko+smoi組同時(shí)給予1mg/10g/天smoi直至取材,而cre-negative+溶劑組與fgfr3cko+溶劑組同時(shí)給予相應(yīng)計(jì)量的smoi溶劑(40%v/w環(huán)糊精水溶液)直至取材。5.記錄smoi治療后小鼠的存活情況,測(cè)量小鼠的身長(zhǎng)及后肢(股骨及脛骨)的長(zhǎng)度,通過(guò)肉眼,x-ray攝像和micro-ct掃描重建,觀察小鼠大體形態(tài)及骨骼系統(tǒng)的變化情況;通過(guò)蘇木精/伊紅染色法和藏紅固綠染色法觀察smoi治療后小鼠生長(zhǎng)板及軟骨腫瘤的組織學(xué)結(jié)構(gòu)。第二部分:1.成年期可誘導(dǎo)條件性敲除軟骨細(xì)胞的fgfr3:2月齡的同窩fgfr3f/f(cre-negative)及fgfr3f/f;col2a1-creert2(fgfr3cko)小鼠,同時(shí)給予1mg/10g/天他莫昔芬(tm)腹腔內(nèi)注射連續(xù)5天;2.通過(guò)x-ray攝像,觀察小鼠頭顱的大體形態(tài)及顳下頜關(guān)節(jié)的變化情況,通過(guò)micro-ct掃描重建,評(píng)估fgfr3敲除后小鼠顳下頜關(guān)節(jié)軟骨下骨的變化情況,通過(guò)蘇木精/伊紅染色法和藏紅固綠染色法觀察小鼠顳下頜關(guān)節(jié)軟骨的組織學(xué)結(jié)構(gòu),通過(guò)免疫組織化學(xué)染色法研究小鼠顳下頜關(guān)節(jié)軟骨中fgfr3,collagenii,pcna,collagenx,mmp13,adamts5,aggrecan,lubricin,runx2和ihh的表達(dá)情況,通過(guò)tunnl檢測(cè)法研究小鼠顳下頜關(guān)節(jié)的軟骨細(xì)胞凋亡情況;3.利用3-4周齡cre-negative和fgfr3cko小鼠顳下頜關(guān)節(jié)的原代軟骨細(xì)胞,研究fgfr3敲除對(duì)軟骨相關(guān)基因col10,mmp13,adamts5,gli1和runx2的表達(dá);4.全身注射smoi:2月齡的同窩fgfr3f/f(cre-negative)及fgfr3f/f;col2a1-creert2(fgfr3cko)小鼠,隨機(jī)分別分為cre-negative+溶劑組,cre-negative+smoi組,fgfr3cko+溶劑組和fgfr3cko+smoi組。cre-negative+smoi組與fgfr3cko+smoi組同時(shí)給予1mg/10g/天smoi直至取材,而cre-negative+溶劑組與fgfr3cko+溶劑組同時(shí)給予相應(yīng)計(jì)量的smoi溶劑(40%v/w環(huán)糊精水溶液)直至取材。5.通過(guò)蘇木精/伊紅染色法和藏紅固綠染色法觀察smoi治療后小鼠顳下頜關(guān)節(jié)軟骨的組織學(xué)結(jié)構(gòu),通過(guò)免疫組織化學(xué)染色法觀察smoi治療后小鼠顳下頜關(guān)節(jié)軟骨中l(wèi)ubricin的表達(dá)情況。第三部分:1.通過(guò)免疫組織化學(xué)染色法觀察小鼠健康與ptoa關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中fgf9的表達(dá)情況;2.建立人全層關(guān)節(jié)軟骨培養(yǎng)模型:將培養(yǎng)的人全層關(guān)節(jié)軟骨塊隨機(jī)分為空白組,fgf9組,白介素-1β(interleukin-1β,il-1β)組和il-1+fgf9組,通過(guò)藏紅固綠染色法觀察其組織學(xué)結(jié)構(gòu),通過(guò)免疫組織化學(xué)染色法研究其中collagenii,collagenx和mmp13的表達(dá)情況;3.將人原代軟骨細(xì)胞隨機(jī)分4個(gè)組,分別為空白組,fgf9組,il-1β組和il-1+fgf9組,檢測(cè)其中aggrecan和mmp13的蛋白表達(dá)變化;4.建立手術(shù)誘導(dǎo)的ptoa模型:內(nèi)側(cè)半月板不穩(wěn)定(destabilizationofthemedialmeniscus,dmm)模型。dmm手術(shù)即是在體視顯微鏡下手術(shù)切除小鼠內(nèi)側(cè)半月板脛骨韌帶,造成關(guān)節(jié)不穩(wěn)定從而導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)軟骨磨損。對(duì)同窩雄性c3h背景的野生型小鼠右側(cè)膝關(guān)節(jié)進(jìn)行dmm手術(shù),并對(duì)左側(cè)膝關(guān)節(jié)進(jìn)行假手術(shù)(切開(kāi)關(guān)節(jié)腔后即縫合)。5.膝關(guān)節(jié)內(nèi)局部注射fgf9:將小鼠膝關(guān)節(jié)隨機(jī)分成4個(gè)組,分別是假手術(shù)+鹽水組,假手術(shù)+fgf9組,dmm+鹽水組和dmm+fgf9組。dmm手術(shù)和假手術(shù)后的第二周,對(duì)相應(yīng)分組小鼠膝關(guān)節(jié)分別注射5μlfgf9(濃度為5μl生理鹽水加入1μgfgf9)與5μl生理鹽水。隨后,2次/周注射相應(yīng)試劑直至取材。6.通過(guò)micro-ct掃描重建,評(píng)估fgf9關(guān)節(jié)內(nèi)局部注射后小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨下骨的變化情況,通過(guò)藏紅固綠染色法和阿爾新藍(lán)/蘇木精/伊紅染色法觀察fgf9關(guān)節(jié)內(nèi)局部注射后小鼠膝關(guān)節(jié)組織學(xué)結(jié)構(gòu)變化。通過(guò)oarsi(osteoarthritisresearchsocietyinternational)推薦方法對(duì)其關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)丟失和損傷情況進(jìn)行評(píng)分,通過(guò)免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨中collagenii,collagenx,mmp13和cleavedcaspase-3的表達(dá)情況,以及在骨贅形成處collagenii,pcna和sox9的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1.軟骨細(xì)胞內(nèi)特異性fgfr3功能失活能直接導(dǎo)致混合性軟骨瘤樣改變1.青春期軟骨細(xì)胞內(nèi)特異性fgfr3功能失活導(dǎo)致小鼠身長(zhǎng)和后肢長(zhǎng)度明顯增加,并且全身多處出現(xiàn)軟骨腫瘤樣占位。組織學(xué)切片染色發(fā)現(xiàn)小鼠生長(zhǎng)板增寬,軟骨細(xì)胞排列紊亂,骨髓腔內(nèi)出現(xiàn)內(nèi)生型軟骨瘤樣占位,骨皮質(zhì)出現(xiàn)外生型軟骨瘤(骨軟骨瘤,外生型骨疣)樣占位等;2.軟骨細(xì)胞內(nèi)特異性fgfr3功能失活導(dǎo)致小鼠生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞極性紊亂,增殖活性增強(qiáng),分化加快以及凋亡降低等;3.軟骨細(xì)胞內(nèi)特異性fgfr3功能失活下調(diào)軟骨細(xì)胞的erk1/2的磷酸化,并促進(jìn)其ihh/pthrp的表達(dá);4.通過(guò)全身系統(tǒng)注射ihh信號(hào)阻斷劑能顯著抑制小鼠軟骨細(xì)胞內(nèi)特異性fgfr3功能失活所導(dǎo)致的混合性軟骨瘤樣改變的發(fā)生。2.fgfr3參與成年期顳下頜關(guān)節(jié)軟骨的穩(wěn)態(tài)維持1.成年期軟骨細(xì)胞內(nèi)特異性fgfr3功能失活對(duì)小鼠顳下頜關(guān)節(jié)的大體形態(tài)未見(jiàn)明顯的影響;然而,fgfr3cko小鼠的顳下頜關(guān)節(jié)軟骨出現(xiàn)明顯oa的變化,包括軟骨細(xì)胞減少,基質(zhì)丟失和軟骨表面裂隙等;2.成年期軟骨細(xì)胞內(nèi)特異性fgfr3功能失活導(dǎo)致小鼠顳下頜關(guān)節(jié)軟骨collagenx,mmp13和adamts5的表達(dá)明顯升高,而aggrecan和lubricin的表達(dá)明顯下降;此外,tunel陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多,顳下頜關(guān)節(jié)軟骨下骨出現(xiàn)明顯骨量增多;然而,pcna的表達(dá)未見(jiàn)明顯的變化;3.成年期軟骨細(xì)胞內(nèi)特異性FGFR3功能失活的導(dǎo)致小鼠顳下頜關(guān)節(jié)軟骨中IHH和RUNX2表達(dá)明顯升高;在顳下頜關(guān)節(jié)原代軟骨細(xì)胞中,IHH信號(hào)阻斷劑(SMOi)能顯著降低由FGFR3功能失活導(dǎo)致的Runx2,Col10,Mmp13和Adamts5高表達(dá);4.通過(guò)全身系統(tǒng)注射SMOi能顯著抑制成年期小鼠軟骨細(xì)胞內(nèi)特異性FGFR3功能失活所導(dǎo)致的顳下頜關(guān)節(jié)OA的發(fā)生。三、關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射外源性FGF9能明顯緩解DMM手術(shù)所導(dǎo)致的PTOA1.DMM后小鼠關(guān)節(jié)軟骨的FGF9表達(dá)明顯下降;2.關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射外源性FGF9能明顯緩解DMM手術(shù)所導(dǎo)致的關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)丟失,Collagen X和MMP13的表達(dá)升高等;同時(shí),在人關(guān)節(jié)軟骨組織培養(yǎng)模型中,外源性FGF9能顯著緩解IL-1β刺激所導(dǎo)致的軟骨基質(zhì)丟失,Collagen X和MMP13的表達(dá)升高等;3.關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射外源性FGF9會(huì)導(dǎo)致DMM手術(shù)所致的小鼠關(guān)節(jié)骨贅明顯變大;4.關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射外源性FGF9能明顯上調(diào)DMM手術(shù)所導(dǎo)致的關(guān)節(jié)骨贅處細(xì)胞PCNA,SOX9和Collagen II的表達(dá)。結(jié)論:一、青年期軟骨細(xì)胞內(nèi)FGFR3功能失活能通過(guò)上調(diào)IHH信號(hào)直接導(dǎo)致混合性軟骨腫瘤的發(fā)生;二、成年期軟骨細(xì)胞內(nèi)FGFR3功能失活能通過(guò)上調(diào)IHH/RUNX2信號(hào)通路導(dǎo)致顳下頜關(guān)節(jié)OA發(fā)生;三、關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射外源性FGF9能保護(hù)PTOA中的軟骨細(xì)胞免于退變,同時(shí)促進(jìn)骨贅的生成。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R738.3

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4 金e，

本文編號(hào)：2263456