【摘要】：目的:肺癌發(fā)病率在我國已居男性各種腫瘤的首位,然而其發(fā)病機(jī)制尚不完全明確。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多個基因與肺癌有密切的關(guān)系如:ras、myc、p53等。最近幾年,全基因組關(guān)聯(lián)分析(Genome-wide association study,GWAS)發(fā)現(xiàn)許多新的單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphisms,SNPs)與肺癌密切相關(guān),部分SNPs位于基因的內(nèi)含子或基因間區(qū)域,其作用機(jī)制尚不明確。因此,我們選取了6個新發(fā)現(xiàn)的與肺癌相關(guān)的SNPs進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,篩選出與肺癌相關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn),進(jìn)而對與肺癌有關(guān)聯(lián)的SNPs作用機(jī)制進(jìn)行了探討,為更進(jìn)一步了解肺癌的發(fā)生發(fā)展提供理論基礎(chǔ),尋找分子治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。方法:本實(shí)驗(yàn)分為兩部分進(jìn)行,第一部分主要研究候選SNPs與肺癌的關(guān)聯(lián)分析,篩選出與肺癌相關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn),第二部分則主要研究該SNP位點(diǎn)的作用機(jī)制。第一部分實(shí)驗(yàn),通過病例-對照研究,采用SNa Pshot分型技術(shù),在391例病例組和342例對照組人群中,對候選的6個SNPs進(jìn)行了分型,然后通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)與肺癌相關(guān)SNP位點(diǎn)的易感基因。第二部分實(shí)驗(yàn)中,我們過表達(dá)了SNAI1,然后采用Luciferase實(shí)驗(yàn)對rs2853677位點(diǎn)所在區(qū)域的序列對TERT基因的調(diào)控功能進(jìn)行了分析。利用電泳遷移率實(shí)驗(yàn)(Electrophoretic Mobility Shift Assay,EMSA)、染色體免疫沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,Ch IP)實(shí)驗(yàn)證明了SNP位點(diǎn)所在區(qū)域與蛋白質(zhì)的相互作用進(jìn)行了檢測。最后通過染色體構(gòu)像捕獲(Chromosome Conformation Capture,3C)技術(shù)對rs2853677位點(diǎn)所在區(qū)域與TERT基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近區(qū)域的空間構(gòu)象進(jìn)行了分析。結(jié)果:第一部分實(shí)驗(yàn),通過對6個SNPs位點(diǎn)rs753955、rs2853677、rs2736100、rs4488809、rs2741354、rs12296850基因分型,對肺癌發(fā)病進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)rs2853677位點(diǎn)、rs2736100位點(diǎn)和rs12296850位點(diǎn)與肺癌(腺癌)的發(fā)生有關(guān)聯(lián),rs2853677位點(diǎn)上突變的等位基因C和rs2736100位點(diǎn)上突變的等位基因G增加罹患腺癌的風(fēng)險(xiǎn),而rs12296850位點(diǎn)上突變的等位基因G降低罹患腺癌的風(fēng)險(xiǎn)。上述3個SNPs位點(diǎn)在中國人群中得到證實(shí),其可在中國人群中用于預(yù)防腫瘤發(fā)生檢測的標(biāo)志位點(diǎn)。第二部分實(shí)驗(yàn),我們選取了rs2853677位點(diǎn)進(jìn)行進(jìn)一步分析。Lucifer報(bào)告基因表明rs2853677位點(diǎn)上下游1kb區(qū)域具有增強(qiáng)TERT啟動子活性的功能,且其增強(qiáng)TERT啟動子活性的功能受rs2853677位點(diǎn)多態(tài)性影響。EMSA實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)rs2853677位點(diǎn)為等位基因T時,SNAI1可與該位點(diǎn)附近序列結(jié)合,而該位點(diǎn)為等位基因C時則不結(jié)合;Ch IP實(shí)驗(yàn)則證明在T/T純合的H446細(xì)胞系中SNAI1可與rs2853677位點(diǎn)結(jié)合而C/C純合的H209細(xì)胞系中SNAI1則不與rs2853677位點(diǎn)結(jié)合,SNAI1與該位點(diǎn)的結(jié)合則可以抑制增強(qiáng)子的活性,從而降低TERT基因的表達(dá)水平。染色質(zhì)構(gòu)象捕獲(3C)技術(shù)確認(rèn)了rs2853677位點(diǎn)與TERT基因啟動子區(qū)存在空間上的相互靠近,更進(jìn)一步驗(yàn)證了該區(qū)域存在TERT基因增強(qiáng)子。結(jié)論:通過本研究我們發(fā)現(xiàn)在中國人群中rs2853677位點(diǎn)與肺癌(腺癌)發(fā)生相關(guān),該位點(diǎn)上突變的等位基因C增加罹患肺癌(腺癌)的風(fēng)險(xiǎn)。rs2853677位點(diǎn)所在1kb區(qū)域存在增強(qiáng)子而調(diào)控TERT的表達(dá),同時rs2853677位點(diǎn)可作為轉(zhuǎn)錄因子SNAI1的結(jié)合位點(diǎn)且該SNP位點(diǎn)多態(tài)性可影響轉(zhuǎn)錄因子SNAI1與該區(qū)域的結(jié)合的親和力。SNAI1與該位點(diǎn)的結(jié)合則可有效降低存在于該區(qū)域的TERT基因增強(qiáng)子的活性,從而降低TERT基因的表達(dá)水平。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R734.2

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本文編號：2262569