【摘要】：第一部分Irx3促進肝內(nèi)脂質(zhì)蓄積和肝脂肪變的研究目的：研究Irx3在肝內(nèi)脂質(zhì)代謝中的作用及其分子機制。方法：通過尾靜脈注射過表達或沉默Irx3的腺病毒及對照腺病毒的方法,在小鼠體內(nèi)上調(diào)或下調(diào)Irx3的表達,并給予正常或高脂飲食12周,檢測小鼠肝組織學變化、脂質(zhì)蓄積情況及脂滴相關(guān)蛋白的表達水平。在轉(zhuǎn)染Irx3過表達腺病毒或?qū)φ障俨《镜男∈蟾渭毎?下調(diào)Fsp27β或Perilipin 1的表達,并給予400μmol/l油酸誘導,檢測肝細胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積情況。此外,我們使用染色質(zhì)免疫共沉淀和報告基因熒光素酶檢測等分子生物學的方法,研究Irx3是否能夠轉(zhuǎn)錄激活Fsp27β或Perilipin1的表達。結(jié)果：上調(diào)肝內(nèi)Irx3的表達可促進肝內(nèi)脂質(zhì)蓄積和肝脂肪變,以及增加Fsp27β和Perilipin 1的表達；相反,下調(diào)肝內(nèi)Irx3的表達可抵抗高脂飲食誘導的肝脂肪變,降低Fsp27β和Perilipin 1的表達水平。但是脂滴相關(guān)蛋白Cidea、Cideb、Atg1、Cgi-58和Perilipin2-4的表達不受Irx3表達變化的影響。與對照腺病毒轉(zhuǎn)染的肝細胞相比,Irx3過表達腺病毒轉(zhuǎn)染的肝細胞內(nèi)TG含量明顯增加,但是在腺病毒介導的Irx3過表達的肝細胞內(nèi)下調(diào)F sp27β或Perilipin 1的表達,導致細胞內(nèi)TG含量顯著性降低。染色質(zhì)免疫共沉淀和報告基因熒光素酶檢測結(jié)果顯示,Irx3能與Fsp27β和Perilipin 1的基因啟動子片段結(jié)合,而過表達Irx3增強Fsp27pβ和Perilipin 1的基因啟動子報告基因的熒光素酶活性。結(jié)論：Irx3通過轉(zhuǎn)錄激活Fsp27β和Perilipin 1的表達,促進肝內(nèi)脂質(zhì)蓄積和肝脂肪變。第二部分IRX3在肝細胞癌中的作用及表達調(diào)控研究目的：研究IRX3在肝細胞癌(Hepatocellular Carcinoma, HCC)中的作用,并從miRNA的角度探討其表達調(diào)控機制。方法：采用qRT-PCR和Western blot方法檢測HCC細胞系(HepG2和SMMC7721)和永生化肝細胞系L02中IRX3和miR-377表達水平：慢病毒轉(zhuǎn)染HCC細胞構(gòu)建IRX3穩(wěn)定表達和沉默的穩(wěn)定細胞株HepG2-shIRX3和SMMC7721-IRX3;采用CCK-8和克隆形成實驗檢測細胞的增殖和克隆形成能力；采用劃痕實驗和Transwell侵襲實驗檢測細胞遷移和侵襲能力;將miR-377 mimics或Control mimics轉(zhuǎn)染入HCC細胞,QRT-PCR和Western blot方法檢測miR-377對IRX3的調(diào)控作用：運用報告基因技術(shù)證實miR-377是否可直接結(jié)合IRX33'UTR;將]miR-377 mimics轉(zhuǎn)染入SMMC7721-IRX3細胞,CCK8、克隆形成、劃痕和Transwell實驗觀察miR-377是否能拮抗IRX3對細胞增殖、遷移和侵襲的促進作用。結(jié)果：HepG2和SMMC7721細胞中IRX3 mRNA和蛋白水平均顯著高于L02細胞；CCK-8實驗結(jié)果顯示,與陰性對照相比,上調(diào)IRX3顯著提高了SMMC7721細胞的生長,而下調(diào)IRX3抑制了HepG2細胞的生長；克隆形成實驗顯示,SMMC7721-IRX3細胞比對照細胞產(chǎn)生了更多的細胞克隆,HepG2-shIRX3細胞產(chǎn)生的細胞克隆少于對照細胞；劃痕實驗和Transwell實驗顯示,上調(diào)IRX3顯著增強了SMMC7721的遷移和侵襲能力,而下調(diào)IRX3顯著降低了HepG2細胞的遷移和侵襲能力；miR-377在HepG2和SMMC7721細胞中低表達：與轉(zhuǎn)染Control mimics相比,轉(zhuǎn)染了miR-377 mimics的HepG2和SMMC7721細胞中IRX3的蛋白表達水平明顯降低,mRNA水平無明顯差異;報告基因?qū)嶒烇@示,miR-377顯著降低了IRX3-3'UTR-WT的熒光素酶活性,而IRX3-3'UTR-MUT不受miR-377影響；miR-377過表達消除了過表達IRX3對SMMC7721細胞增殖、遷移和侵襲的促進作用。結(jié)論：IRX3在HCC細胞系中高表達,增強細胞增殖、遷移和侵襲能力：IRX3是niR-377的靶基因;HCC細胞中miR-377低表達可能導致了IRX3的高表達。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R575.5;R735.7

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本文編號：2262327