【摘要】：無論是在發(fā)達(dá)國家還是在發(fā)展中國家,癌癥都已經(jīng)成為威脅人類生命的一個主要的疾病。目前,癌癥是美國的第二大死亡原因,并在未來幾年內(nèi)可能超越心臟病成為因病致死的首要原因。2012年全世界就有180萬新增肺癌患者,約占當(dāng)年診斷癌癥的13%。2015年最新統(tǒng)計當(dāng)中,肺癌在男性中將超越前列腺癌,在女性中將超越乳腺癌,成為最主要的癌癥死亡原因。目前,我國的肺癌發(fā)病率及死亡率均排在所有惡性腫瘤首位,而且每年仍呈上升的趨勢。87%的肺癌患者為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC),其五年生存率僅為18.2%。目前,對大多數(shù)早期的非小細(xì)胞肺癌患者可行手術(shù)治療,對于失去于術(shù)時機的患者,則采取放化療或靶向治療的策略,其中靶向治療對晚期非小細(xì)胞肺癌的重要性日益增加。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)在非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展中扮演著至關(guān)重要的作用,大約有40%-80%的非小細(xì)胞肺癌患者檢測到EGFR異常高表達(dá)。同時在非小細(xì)胞肺癌中,EGFR往往發(fā)生突變。EGFR常見敏感突變也稱為經(jīng)典激活突變,包括外顯子19的缺失突變和外顯子21的L858R點突變,共占所有EGFR激活突變的90%左右。EGFR激活突變改變了激酶活性與非活性構(gòu)象之間的平衡,使激酶構(gòu)象不穩(wěn)定,從而導(dǎo)致激酶的結(jié)構(gòu)性激活。正因為EGFR在腫瘤發(fā)生中的重要作用,一系列EGFR酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor, TKIs),包括吉非替尼和厄洛替尼等被研發(fā)并作為有效的臨床治療手段用于EGFR敏感突變的患者。其作用機理為胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域中腺苷三磷酸(adenosine triphosphate, ATP)結(jié)合口袋被TKIs阻斷,酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域與TKIs結(jié)合后阻斷配體誘導(dǎo)的受體自磷酸化,從而阻斷了酪氨酸激酶活性,抑制胞內(nèi)下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。然而,非小細(xì)胞肺癌患者在服用吉非替尼或厄洛替尼6-12個月后會出現(xiàn)EGFR TKIs繼發(fā)耐藥。吉非替尼繼發(fā)耐藥的機制繁雜,c-Met基因擴增、HER2基因擴增、K-Ras基因突變、PTEN缺失等都曾被報道過與TKIs原發(fā)或者繼發(fā)耐藥的發(fā)生相關(guān)�，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn),有50%的吉非替尼繼發(fā)耐藥與EGFR的二次突變(主要為T790M突變)有關(guān),表現(xiàn)為EGFR外顯子20的二次突變,即在激酶結(jié)構(gòu)域中790位點的蘇氨酸被蛋氨酸取代。研究指出,EGFR蛋白外顯子20中790位點的蘇氨酸被認(rèn)為是一個“門衛(wèi)”殘基,是決定TKIs在EGFR ATP結(jié)合口袋發(fā)揮特異性的一個重要因素。T790M突變導(dǎo)致TKIs繼發(fā)耐藥是由于該突變增加了EGFR對ATP的親和力,減弱了TKIs與ATP競爭抑制激酶的效力。雖然由于TKIs治療產(chǎn)生的耐藥性與日俱增,但目前與之相應(yīng)的對策卻捉襟見肘。因此,發(fā)現(xiàn)一種可以作用于T790M突變的新型小分子化合物從而在非小細(xì)胞肺癌治療中克服吉非替尼耐藥具有非常迫切且重要的臨床意義。本研究中,基于尋找治療非小細(xì)胞肺癌并能夠克服吉非替尼耐藥的新型小分子化合物的目的,我們應(yīng)用超級計算機篩選,在ZINC天然化合物數(shù)據(jù)庫中篩選出了一個潛在的EGFR抑制劑,2-(4-(4-methoxyphenoxy)-lH-pyrazol-3-yl)-5-(p-tolylmethoxy)phenol (244-MPT)。我們發(fā)現(xiàn)這個小分子化合物在體外及體內(nèi)實驗中,通過作用于EGFR及其下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路從而抑制吉非替尼敏感和耐藥非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞生長。更重要的是,我們發(fā)現(xiàn)在裸鼠移植瘤模型及非小細(xì)胞肺癌吉非替尼耐藥的人組織來源的移植瘤模型中244-MPT能夠有效抑制吉非替尼耐藥肺癌腫瘤的生長。第一章244-MPT抑制非小細(xì)胞肺癌的錨定非依賴生長及細(xì)胞增殖方法1.利用超級計算機虛擬篩選模型尋找能夠結(jié)合EGFR的候選靶點抑制劑。2.檢測化合物244-MPT對肺正常細(xì)胞毒性。3.軟瓊脂克隆形成實驗檢測化合物244-MPT對于吉非替尼敏感和耐藥非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系的錨定非依賴生長的影響。4.細(xì)胞增殖實驗檢測化合物244-MPT對于吉非替尼敏感和耐藥非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系的增殖的影響。結(jié)果1.244-MPT具有潛在的同時抑制野生型及突變型EGFR激酶的能力根據(jù)超級計算機模擬篩選模型,我們得到一個根據(jù)對接打分程序給出的得分由高到低排名前十的針對野生型及突變型EGFR的抑制劑清單,根據(jù)清單綜合排名,我們找到EGFR候選抑制劑244-MPT。2.244-MPT對正常肺成纖維細(xì)胞無明顯毒性MTS實驗結(jié)果表明：MRC-5肺正常細(xì)胞的增殖效率對照組與244-MPT處理組并無顯著差異。這提示：244-MPT對MRC-5肺正常細(xì)胞并不具有顯著的細(xì)胞毒性。3.244-MPT抑制吉非替尼敏感和耐藥肺癌細(xì)胞的錨定非依賴生長軟瓊脂克隆形成實驗結(jié)果表明：在吉非替尼敏感非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株HCC827中,化合物244-MPT在濃度為10μM時顯著抑制了該細(xì)胞的克隆形成。而在吉非替尼耐藥非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株H1975中,吉非替尼對H1975耐藥細(xì)胞株的克隆形成能力無任何抑制作用,而244-MPT劑量依賴性抑制吉非替尼耐藥肺癌細(xì)胞株的錨定非依賴生長。4.244-MPT抑制吉非替尼敏感和耐藥肺癌細(xì)胞的增殖細(xì)胞增殖實驗結(jié)果表明：化合物244-MPT濃度依賴性抑制吉非替尼敏感和耐藥肺癌細(xì)胞株的生長,而吉非替尼對吉非替尼耐藥非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株生長無任何作用。第二章244-MPT體外結(jié)合并抑制野生型及突變型EGFR蛋白激酶的活性方法1. 超級計算機模擬化合物244-MPT與靶標(biāo)蛋白的相互作用。2.化合物244-MPT的EGFR蛋白激酶ATP競爭抑制實驗。3.化合物244-MPT蛋白下拉實驗。4.化合物244-MPT EGFR體外激酶活性實驗。結(jié)果1 244-MPT與EGFR蛋白激酶的ATP結(jié)合區(qū)域結(jié)合超級計算機模擬實驗證明：小分子化合物244-MPT與野生型及L858R/T790M雙突變EGFR的ATP結(jié)合口袋存在相互作用,能與這一結(jié)構(gòu)結(jié)合形成復(fù)合物。2 244-MPT與EGFR蛋白激酶的ATP結(jié)合區(qū)域結(jié)合,并競爭抑制ATPATP競爭實驗結(jié)果證明：小分子化合物244-MPT作用于野生型及L858R/T790M雙突變型EGFR的ATP結(jié)合口袋,并劑量依賴性競爭抑制ATP與EGFR的結(jié)合。3 244-MPT與EGFR蛋白在細(xì)胞水平結(jié)合蛋白下拉實驗證明：小分子化合物244-MPT能與野生型及L858R/T790M雙突變型EGFR相互作用,形成復(fù)合物。4 244-MPT體外抑制野生型及L858R/T790M雙突變型EGFR激酶活性EGFR體外激酶實驗結(jié)果顯示：244-MPT對野生型及L858R/T790M雙突變EGFR激酶活性具有明顯抑制作用。這一結(jié)果說明,244-MPT確實能顯著抑制EGFR的激酶活性。第三章244-MPT抑制EGFR激酶信號通路方法1. Western blot檢測吉非替尼敏感和耐藥非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株處理244-MPT對于EGFR激酶下游通路的影響。2.慢病毒轉(zhuǎn)染法在人肺正常上皮細(xì)胞中過表達(dá)EGFR,建立穩(wěn)定過表達(dá)細(xì)胞株。3.244-MPT處理EGFR過表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞株,Western blot檢測EGFR激酶下游通路。結(jié)果1.244-MPT抑制吉非替尼敏感和耐藥肺癌細(xì)胞內(nèi)EGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化Western blot結(jié)果表明：244-MPT能顯著抑制吉非替尼敏感和耐藥肺癌細(xì)胞EGFR激酶的磷酸化,以及下游信號Akt及ERK1/2激酶的磷酸化。這提示：不論是吉非替尼敏感非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株還是吉非替尼耐藥非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株,244-MPT均能夠抑制細(xì)胞內(nèi)EGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化。2.慢病毒轉(zhuǎn)染法建立人正常上皮細(xì)胞EGFR過表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞系Western blot結(jié)果表明：NL20肺上皮細(xì)胞可過表達(dá)野生型及不同突變型EGFR,通過慢病毒轉(zhuǎn)染可成功構(gòu)建EGFR過表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞系。3.244-MPT抑制不同基因型EGFR過表達(dá)細(xì)胞系內(nèi)EGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路244-MPT能顯著抑制不同基因型EGFR過表達(dá)細(xì)胞系EGFR激酶磷酸化,下游信號Akt及ERK1/2激酶的磷酸化。這提示：244-MPT能夠抑制野生型、單突變型、亦或雙突變型EGFR細(xì)胞株中EGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化。第四章244-MPT誘導(dǎo)吉非替尼耐藥非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株凋亡方法1. 流式細(xì)胞儀檢測244-MPT處理吉非替尼耐藥肺癌細(xì)胞株是否誘導(dǎo)其凋亡2. Western blot檢測244-MPT處理吉非替尼耐藥肺癌細(xì)胞株對凋亡信號的影響。3. TUNEL檢測244-MPT處理吉非替尼耐藥肺癌細(xì)胞株是否誘導(dǎo)其凋亡,導(dǎo)致細(xì)胞核碎裂。結(jié)果1.244-MPT誘導(dǎo)吉非替尼耐藥肺癌細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞儀結(jié)果表明：244-MPT能顯著誘導(dǎo)吉非替尼耐藥肺癌細(xì)胞凋亡2.244-MPT誘導(dǎo)吉非替尼耐藥肺癌細(xì)胞凋亡,引起凋亡相關(guān)信號改變Western blot結(jié)果表明：244-MPT能夠誘導(dǎo)凋亡,顯著改變凋亡相關(guān)信號。3.244-MPT誘導(dǎo)吉非替尼耐藥肺癌細(xì)胞凋亡,引起細(xì)胞核碎裂TUNEL結(jié)果證實：244-MPT引起吉非替尼耐藥肺癌細(xì)胞核碎裂,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。第五章244-MPT抑制吉非替尼耐藥非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的體內(nèi)瘤體生長方法1. 利用吉非替尼耐藥非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株H1975裸鼠移植瘤模型檢測化合物244-MPT對吉非替尼耐藥非小細(xì)胞肺癌的抗癌效果。2. 免疫組織化學(xué)檢測吉非替尼耐藥非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株H1975裸鼠異種移植瘤腫瘤組織EGFR、Akt、ERK1/2磷酸化水平及增殖標(biāo)志Ki-67水平。結(jié)果1.244-MPT抑制吉非替尼耐藥非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株H1975裸鼠移植瘤生長動物模型實驗結(jié)果顯示：裸鼠的體重并沒有隨著244-MPT給藥有明顯的降低或波動,且腫瘤的大小受到劑量依賴性抑制。而吉非替尼處理組無明顯抑制。這些結(jié)果說明,244-MPT能在體內(nèi)抑制吉非替尼耐藥非小細(xì)胞肺癌移植瘤生長且無明顯毒副作用。2.244-MPT體內(nèi)抑制增殖指標(biāo)Ki-67,以及EGFR、Akt和ERKl/2磷酸化免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：與安慰劑對照組和吉非替尼處理組相比,244-MPT處理組Ki-67的表達(dá)明顯被抑制,且EGFR、Akt和ERK1/2磷酸化水平顯著下調(diào)。免疫組化的結(jié)果進(jìn)一步證實了244-MPT抑制H1975移植瘤生長是通過抑制EGFR信號通路實現(xiàn)的。第六章244-MPT抑制非小細(xì)胞肺癌吉非替尼耐藥的人組織來源的移植瘤生長方法1.建立非小細(xì)胞肺癌人組織來源的移植瘤模型及誘導(dǎo)構(gòu)建其吉非替尼耐藥模型。2.利用非小細(xì)胞肺癌吉非替尼耐藥的人組織來源的移植瘤模型檢測化合物244-MPT對吉非替尼耐藥的非小細(xì)胞肺癌的抗癌效果。3.免疫組織化學(xué)檢測非小細(xì)胞肺癌吉非替尼耐藥的人組織來源的移植瘤增殖標(biāo)志分子Ki-67, EGFR、Akt和ERK1/2磷酸化水平。結(jié)果1.244-MPT抑制非小細(xì)胞肺癌吉非替尼耐藥的人組織來源的移植瘤生長動物模型實驗結(jié)果顯示：荷瘤小鼠隨著244-MPT給藥,腫瘤體積明顯小于安慰劑對照組及吉非替尼處理組,且SCID小鼠的體重并沒有隨著244-MPT給藥有明顯的降低。而吉非替尼處理組對腫瘤生長無明顯抑制。這些結(jié)果說明,244-MPT能夠抑制非小細(xì)胞肺癌吉非替尼耐藥的人組織來源的移植瘤生長且無明顯毒副作用。2.244-MPT體內(nèi)抑制增殖指標(biāo)Ki-67,且抑制EGFR及ERK1/2磷酸化免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：與安慰劑對照組和吉非替尼處理組相比,244-MPT處理組Ki-67的表達(dá)明顯被抑制,且EGFR和ERK1/2磷酸化水平顯著下調(diào)。免疫組化的結(jié)果進(jìn)一步證實了244-MPT對非小細(xì)胞肺癌吉非替尼耐藥的人組織來源的移植瘤的生長抑制與EGFR信號通路被抑制有關(guān)。結(jié)論1.計算機模擬、體外水平、細(xì)胞水平以及體內(nèi)水平的研究結(jié)果證實：244-MPT直接作用于EGFR的ATP結(jié)合區(qū)域上,與EGFR結(jié)合,并通過ATP競爭的方式抑制其異常激活,繼而抑制其下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,最終抑制吉非替尼敏感和耐藥非小細(xì)胞肺癌的生長和增殖。2.吉非替尼耐藥的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株移植瘤及吉非替尼耐藥的非小細(xì)胞肺癌人組織來源的移植瘤模型結(jié)果與細(xì)胞水平實驗結(jié)果相一致。244-MPT能夠有效抑制吉非替尼耐藥的非小細(xì)胞肺癌的生長和增殖,且無明顯毒副作用。這為非小細(xì)胞肺癌的分子靶向治療提供了新的治療選擇。
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【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R734.2
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本文編號：2261994