【摘要】：目的:探討胰腺星狀細(xì)胞(pancreatic stellate cell,PSC)及HGF/c-Met生物軸在胰腺癌(pancreatic cancer,PC)吉西他濱(gemcitabine,GEM)化療耐藥中的作用,從而為以PC腫瘤微環(huán)境為目標(biāo)的靶向治療提供新的突破點(diǎn)。方法:收集PSC和PC細(xì)胞的條件培養(yǎng)基(PSC-conditioned medium,PSC-CM;PCC-conditioned medium,PCC-CM)。用PSC-CM和化療藥物GEM處理PC細(xì)胞SW1990和PANC-1,觀察PC細(xì)胞耐藥表型的變化。采用細(xì)胞增殖與活性檢測試劑盒(Cell Counting Kit 8,CCK-8)檢測GEM對PC細(xì)胞的半數(shù)有效抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50)和生長抑制率的變化,Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測GEM誘導(dǎo)的PC細(xì)胞的凋亡情況,蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western Blot)檢測PC細(xì)胞凋亡蛋白caspase 8和caspase 3的活化水平。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative PCR,qRT-PCR)和Western Blot以及細(xì)胞免疫熒光技術(shù)分析PC細(xì)胞EMT(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)過程中分子標(biāo)記物上皮細(xì)胞鈣黏蛋白(E-Cadherin)和波形蛋白(Vimentin)表達(dá)的變化。采用酶聯(lián)免疫吸附劑測定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)和qRT-PCR及Western Blot技術(shù)分別檢測PSC和PC細(xì)胞中肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)的表達(dá)情況。用PSC-CM培養(yǎng)2種PC細(xì)胞,通過ELISA技術(shù)檢測不同時(shí)間點(diǎn)PSC-CM中HGF的水平。通過Transwell技術(shù)共培養(yǎng)PSC和2種PC細(xì)胞,采用ELISA檢測培養(yǎng)基中HGF的表達(dá)水平。利用外源性人重組HGF(Recombinant Human HGF,rhHGF)孵育PC細(xì)胞,采用qRT-PCR及Western Blot重新檢測PC細(xì)胞中E-Cadherin和Vimentin的表達(dá)變化。應(yīng)用ELISA分析HGF中和抗體AMG102對PSC-CM中HGF水平的影響。qRT-PCR及Western Blot分析PSC-CM及rhHGF對PC細(xì)胞內(nèi)磷酸化的c-Met(p-c-Met)水平的影響。應(yīng)用AMG102和c-Met特異性抑制劑PHA 665752分別阻斷HGF/c-Met信號通路,Western Blot分析PC細(xì)胞內(nèi)p-c-Met水平的變化,并觀察加入AMG102和PHA 665752前后的PSC-CM對PC細(xì)胞化療敏感性的影響及PC細(xì)胞EMT分子標(biāo)記物的表達(dá)變化。最后觀察PSC-CM及rhHGF對PC細(xì)胞內(nèi)磷酸肌醇-3/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(PI3K/Akt)通路的影響。應(yīng)用PI3K/Akt特異性抑制劑LY294002阻斷該通路后,Western Blot分析PC細(xì)胞內(nèi)磷酸化的Akt(p-Akt)蛋白水平的變化,并重新檢測PSC-CM對誘導(dǎo)PC細(xì)胞EMT及對PC細(xì)胞化療抵抗的影響。結(jié)果:1.PSC增強(qiáng)PC細(xì)胞的化療耐藥性。CCK-8結(jié)果顯示,相比于在正常培養(yǎng)基中生長的PC細(xì)胞,GEM對在PSC-CM中生長的SW1990和PANC-1細(xì)胞的IC50值顯著升高,兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.01)。而GEM對在PSC-CM中生長的PC細(xì)胞的生長抑制率則明顯降低,兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.01)。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,在GEM作用下,相比于在正常培養(yǎng)基中生長的PC細(xì)胞,在PSC-CM中生長的PC細(xì)胞的凋亡率也明顯降低,兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.01)。Western Blot結(jié)果顯示,PSC-CM顯著降低了GEM誘導(dǎo)的PC細(xì)胞內(nèi)caspase8和caspase 3的活化水平。2.PSC促進(jìn)PC細(xì)胞發(fā)生EMT。qRT-PCR和Western Blot及細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示,PSC-CM能夠下調(diào)PC細(xì)胞E-Cadherin的表達(dá),上調(diào)Vimentin表達(dá),兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.01)。3.PSC高表達(dá)HGF。qRT-PCR和Western Blot分析顯示,PSC高表達(dá)HGF,PC細(xì)胞則高表達(dá)c-Met,兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.01)。ELISA結(jié)果顯示,PSC-CM中HGF水平高于PCC-CM中,兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.01)。并且在PC細(xì)胞的作用下,PSC-CM中HGF的水平呈時(shí)間依賴性的降低。ELISA結(jié)果也顯示,AMG102能有效降低PSC-CM中HGF的水平,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.01)。此外,PC細(xì)胞能促進(jìn)PSC分泌HGF,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.01)。Western Blot結(jié)果顯示,PSC-CM及rhHGF均能促進(jìn)PC細(xì)胞內(nèi)c-Met的磷酸化水平。4.HGF/c-Met生物軸是促進(jìn)PC細(xì)胞發(fā)生EMT的關(guān)鍵效應(yīng)通路。qRT-PCR和Western Blot結(jié)果顯示,rhHGF能促進(jìn)PC細(xì)胞發(fā)生EMT,兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.01)。此外,Western Blot結(jié)果顯示,AMG102和PHA 665752均能有效地拮抗PSC-CM誘導(dǎo)的p-c-Met水平的增加,亦能減弱由PSC-CM誘導(dǎo)的EMT的發(fā)生。5.c-Met的活化增強(qiáng)了PC細(xì)胞的化療抵抗能力。CCK-8結(jié)果顯示,相比于在PSC-CM中生長的PC細(xì)胞,GEM對在含有PHA 665752的PSC-CM中生長的SW1990和PANC-1細(xì)胞的IC50值明顯降低,兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.01),而GEM對PC細(xì)胞的生長抑制率則升高,兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.01)。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,GEM對在含有PHA 665752的PSC-CM中生長的PC細(xì)胞的總體凋亡比例也顯著增加,與PSC-CM組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.01)。Western Blot結(jié)果也顯示,相比于在PSC-CM中生長的PC細(xì)胞,GEM誘導(dǎo)的在含有PHA 665752的PSC-CM中生長的PC細(xì)胞內(nèi)caspase 8和caspase 3的活化水平明顯升高。6.PSC經(jīng)由HGF/c-Met生物軸活化PI3K/Akt信號通路從而促進(jìn)PC細(xì)胞發(fā)生EMT和增強(qiáng)化療抵抗。Western Blot分析顯示,PSC-CM及rhHGF均能促進(jìn)PC細(xì)胞內(nèi)Akt的磷酸化水平,而LY294002則能抑制PSC-CM及rhHGF誘導(dǎo)的p-Akt水平增加。此外,LY294002還能協(xié)同PHA 665752抑制PSC-CM誘導(dǎo)的PC細(xì)胞EMT的發(fā)生。CCK-8結(jié)果顯示,LY294002能抑制PSC-CM誘導(dǎo)的GEM對PC細(xì)胞的IC50值升高和生長抑制率的降低,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.01)。結(jié)論:PSC高表達(dá)HGF,以旁分泌的方式與PC細(xì)胞的c-Met受體相結(jié)合,經(jīng)由HGF/c-Met生物軸激活PC細(xì)胞內(nèi)的PI3K/Akt信號通路,誘導(dǎo)PC細(xì)胞發(fā)生EMT,并通過降低PC細(xì)胞內(nèi)caspase的活化水平抑制PC細(xì)胞凋亡,從而增強(qiáng)PC細(xì)胞對GEM的化療抵抗。因此,PSC與PC細(xì)胞之間相互作用的靶向研究可能為克服PC化療抵抗指明了新方向,針對HGF/c-Met生物軸及其下游信號通路的靶向治療與GEM協(xié)同作用有可能改善PC患者的臨床結(jié)局。
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【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R735.9

【參考文獻(xiàn)】

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1 Daniel Delitto;Eva Vertes-George;Steven J Hughes;Kevin E Behrns;Jose G Trevino;;c-Met signaling in the development of tumorigenesis and chemoresistance: Potential applications in pancreatic cancer[J];World Journal of Gastroenterology;2014年26期

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本文編號：2261639