【摘要】：研究背景與目的肝細胞癌是世界上較為常見的惡性腫瘤之一,每年有大約70萬例診斷為肝細胞癌的患者,在我國惡性腫瘤死亡分類構(gòu)成中列第2位。目前的主要治療手段為肝切除、消融、肝移植、介入和分子靶向治療,各種治療方法雖然不斷組合與改進,但是患者生存率依然無法顯著提高,主要原因還是術(shù)后的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移,因此肝細胞癌轉(zhuǎn)移機制的研究成為了目前的焦點之一。肝癌的轉(zhuǎn)移主要是指癌細胞的侵襲和遷移,就分子機制而言,是通過一些重要基因和信號通路的調(diào)控來實現(xiàn)的。近年來,Notch信號通路與肝癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系研究較受關(guān)注。研究內(nèi)容主要包括篩選肝癌細胞中異常表達的Notch通路相關(guān)分子,調(diào)控Notch通路相關(guān)信號分子對癌細胞生物學行為(侵襲、遷移、增殖和凋亡等)的影響,以及肝癌高危因素(肝炎病毒、HBx蛋白等)通過Notch信號通路促進肝癌發(fā)生、發(fā)展。IL-24能夠阻滯腫瘤細胞周期,抑制細胞生長,并誘導(dǎo)細胞凋亡。相關(guān)研究表明IL-24基因具有潛在的抗腫瘤性,而且能選擇性的殺傷腫瘤細胞,但是對正常的組織細胞卻沒有影響,這種現(xiàn)象在黑色素瘤細胞、肝癌細胞等腫瘤細胞中都有報道。而且IL-24屬于人體自身產(chǎn)生的細胞因子,沒有毒性作用,甚至能夠提高腫瘤細胞對化療的敏感性,可以減少化療的副作用。本課題通過IL-24聯(lián)合抑制Notch信號通路(Notch通路阻斷劑GSI-I、Notchl siRNA)處理肝癌細胞,從侵襲和遷移、增殖、凋亡幾個方面探討應(yīng)用IL-24和抑制Notch通路所產(chǎn)生的生物學效應(yīng)以及相關(guān)機制。本課題進一步闡明了Notch信號通路在肝細胞癌侵襲、遷移、增殖和凋亡中的作用機制,深入研究了IL-24在這個過程中發(fā)揮的協(xié)同作用,為肝細胞癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的治療提供了一個新的方法。第一部分IL-24聯(lián)合GSI-I對肝細胞癌侵襲遷移及增殖凋亡的影響研究方法利用γ-分泌酶抑制劑-I(GSM)和IL-24分別以及聯(lián)合處理肝癌細胞株(SMMC7721、HepG2)。設(shè)立GSI-I組、IL-24組、GSI-I/IL-24組和對照組,用Transwell實驗檢測肝癌細胞侵襲能力,細胞劃痕實驗檢測肝癌細胞的遷移能力,MTT法檢測各組肝癌細胞增殖,流式細胞儀及Hoechst染色法檢測各組肝癌細胞凋亡情況。Western Blot法檢測各組肝癌細胞Notch相關(guān)信號通路關(guān)鍵分子,以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、凋亡相關(guān)分子表達水平。結(jié)果1.與對照組(Control)比較,GSM單獨處理后,侵襲的HepG2細胞數(shù)目減少(323.3±25.1 vs 175.0±23.1,P0.01),差異有統(tǒng)計學意義；IL-24單獨處理后侵襲的細胞數(shù)目沒有顯著變化(323.3±25.1 vs 307.3±31.3,P0.05)；而IL-24和GSI-I聯(lián)合作用HepG2細胞,發(fā)生侵襲的細胞數(shù)明顯減少(323.3±25.1vs 37.7±31.4,P0.01)。聯(lián)合組與GSI-I單獨作用組相比也有顯著的減少(37.7±31.4 vs 175.0±23.1,P0.01),與IL-24單獨作用組相比同樣有明顯的減少(37.7±31.4 vs 307.3±31.3,P0.01)。與對照組(Control比較,GSI-I單獨處理后穿透Transwell膜的SMMC7721細胞數(shù)目明顯減少(266.7±17.8 vs157.7±14.0,P0.01),差異有統(tǒng)計學意義；IL-24單獨處理后穿透Transwell膜的細胞數(shù)目沒有顯著的差異(266.7±17.8 vs 245.67±21.5,P0.05)；而IL-24和GSI-I聯(lián)合作用SMMC7721細胞,穿透Transwell膜的細胞數(shù)更為明顯的減少(266.7±17.8 vs 76.0±22.3,P0.01),差異有統(tǒng)計學意義。聯(lián)合組與GSI-I單獨作用組相比也有顯著的減少(76.0±22.3 vs 157.7±14.0,P0.01),與IL-24單獨作用組相比同樣有明顯的減少(76.0±22.3 vs 245.67±21.5,P0.01),說明IL-24和GSI-I聯(lián)合作用能比GSI-I單獨作用組更為明顯的抑制肝癌細胞株SMMC7721的侵襲。2.與對照組(Control)比較,GSI-I單獨處理后HepG2細胞劃痕的愈合率有一定程度的下降(83.6+3.9 vs 66.5±4.9,P0.01),差異有統(tǒng)計學意義；IL-24單獨處理后的愈合率也有下降(83.6+3.9 vs 52.6+3.4,P0.01)；而IL-24和GSI-I聯(lián)合作用HepG2細胞,愈合率則有顯著下降(83.6±3.9 vs 6.8±1.9,P0.001)。聯(lián)合組與GSI-I單獨作用組相比也有顯著的減少(6.8±1.9 vs66.5±4.9,P0.001),與IL-24單獨作用組相比同樣有明顯的減少(6.8±1.9vs52.6±3.4,P0.001)。與對照組(Control)比較,GSI-I單獨處理后SMMC7721細胞的愈合率略有下降(56.3±6.8 vs 48.4±7.2,P0.05),差異無統(tǒng)計學意義；IL-24單獨處理后的劃痕愈合率也沒有顯著的差異(56.3±6.8 vs 50.4±5.7,P0.05)；而IL-24和GSI-I聯(lián)合作用SMMC7721細胞,細胞愈合率顯顯的減少(56.3+6.8 vs 25.4±4.0,P0.001),差異有顯著統(tǒng)計學意義。聯(lián)合組與GSM單獨作用組相比也有顯著的減少(25.4±4.0 vs 48.4±7.2,P0.01),與IL-24單獨作用組相比同樣有明顯的減少(25.4±4.0vs 50.4±5.7,P0.01),說明IL-24和GSI-I聯(lián)合作用能比GSI-I單獨作用組更為明顯的抑制肝癌細胞株SMMC7721的遷移。3.低濃度IL-24單獨處理HepG2細胞,SNAIL1、SNAIL2的表達略有降低,對E-cadherin蛋白的表達沒有顯著影響。GSI-I單獨處理,抑制Notch1、SNAIL1、 SNAIL2的表達,SNAIL下游E-cadherin的表達也相應(yīng)的上調(diào)了。IL-24和GSI-I聯(lián)合作用于HepG2細胞,顯著抑制了Notch1蛋白的表達,而且也抑制了EMT相關(guān)蛋白SNAIL1、SNAIL2的表達,同時發(fā)現(xiàn)E-cadherin蛋白表達上調(diào)是伴隨SNAIL蛋白表達下調(diào)發(fā)生的。4.濃度2.5μM的GSI-I單獨作用時,SMMC7721的平均增殖率較對照組(GSI-I濃度OμM)降低了3.5(P0.05),而HepG2的細胞平均增殖率則明顯下降,降低了65.1(P0.01)。IL-24和GSI-I聯(lián)合作用24小時后,SMMC7721表現(xiàn)出了細胞增殖率隨著GSI-I濃度的增加而下降的趨勢。在50ng/ml的IL-24作用下,GSI-I在2.5μM濃度時,SMMC7721的細胞平均增殖率較對照組降低了35.1(P0.05)。而對于肝癌細胞株HepG2,IL-24和GSI-I這種抑制腫瘤細胞生長的效應(yīng)更為明顯,細胞平均增殖率低于20%,較對照降低了83.4(P0.01)。5.經(jīng)GSI-I單獨處理HepG2細胞,較對照組沒有發(fā)生明顯的凋亡。IL-24單獨處理HepG2細胞,出現(xiàn)了部分細胞的凋亡,而且以早期凋亡為主。IL-24和GSI-I聯(lián)合作用HepG2細胞的凋亡率為14.81±1.33,與對照組和單獨作用的實驗組相比有顯著的差異(P0.01)。經(jīng)GSI-I單獨處理SMMC7721細胞,凋亡率與對照組沒有顯著差異(P0.05)。IL-24單獨處理HepG2細胞,凋亡率較對照組有升高(P0.05)。IL-24和GSI-I聯(lián)合作用組,凋亡率與對照組和GSI-I單獨處理組相比皆有顯著的增加(P0.01),與IL-24單獨處理組相比也有升高(P0.05)。結(jié)論1.IL-24雖然自身只有較弱的抑制肝癌細胞的遷移的作用,也沒有發(fā)現(xiàn)抑制侵襲的作用,但是IL-24能夠顯著增強GSI-I對肝癌侵襲遷移的抑制作用,發(fā)揮了協(xié)同抑制效應(yīng)。2.IL-24和GSI-I聯(lián)合作用抑制肝癌細胞的侵襲遷移,是通過顯著上調(diào)E-cadherin以及下調(diào)MMP-2實現(xiàn)的。3.IL-24和GSI-I聯(lián)合作用能夠顯著的抑制肝癌細胞增殖,同時還有下調(diào)XIAP,明顯誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡的作用。4.IL-24和GSI-I聯(lián)合應(yīng)用有可能成為肝細胞癌治療的一個新方法。第二部分IL-24聯(lián)合siNotchl對肝細胞癌侵襲和凋亡的作用研究方法為進一步確認IL-24和GSI-I是通過Notch通路發(fā)揮的作用,我們選擇Notch1為作用靶點,設(shè)計了該基因的小干擾RNA(small interference RNA,siRNA),用Notch1的siRNA從基因水平下調(diào)Notch1,阻斷該信號通路,再次檢測對肝癌細胞的侵襲、凋亡以及EMT相關(guān)蛋白的表達情況,以及IL-24在該過程中發(fā)揮的協(xié)同抑制效應(yīng)。設(shè)立siNotch1組、IL-24組、siNotch1/IL-24組和空白對照組,檢測各組肝癌細胞株HepG2侵襲和凋亡,Western Blot法檢測Notch信號通路關(guān)鍵分子表達,以及EMT相關(guān)分子和凋亡相關(guān)分子表達水平,用PARP和Caspase3/7檢測試劑盒檢測HepG2的凋亡。結(jié)果1.與對照組(Control)比較,siNotch1單獨處理后侵襲的HepG2細胞數(shù)目減少(508.7±14.6 vs 196.7±13.9,P0.01),差異有統(tǒng)計學意義：IL-24單獨處理后侵襲的細胞數(shù)目沒有顯著減少(508.7±14.6 vs 496.0±15.4,P0.05)；而IL-24和siNotch1聯(lián)合組,發(fā)生侵襲的HepG2細胞數(shù)明顯減少(508.7±±14.6 vs27.7±±7.6,P0.01)。聯(lián)合組與siNotch1單獨作用組相比也有顯著的減少(27.7±7.6 vs 196.7±±13.9,P0.01),與IL-24單獨作用組相比同樣有明顯的減少(27.7±±7.6 vs 496.0±15.4,P0.01),說明IL-24和siNotch1聯(lián)合作用能夠比單獨作用組更為明顯的抑制肝癌細胞株HepG2的侵襲。2.低濃度IL-24單獨處理HepG2細胞,SNAIL1、SNAIL2的表達略有降低,對E-cadherin蛋白的表達沒有顯著影響。siNotch1單獨處理,抑制Notch1、SNAIL1、 SNAIL2的表達,SNAIL下游E-cadherin的表達相應(yīng)的上調(diào)。IL-24和siNotch1聯(lián)合作用于HepG2細胞,由于干擾了Notch1基因的表達而使Notch1蛋白的表達下調(diào),同時發(fā)現(xiàn)EMT相關(guān)蛋白、SNAIL2表達下調(diào)。仔細研究發(fā)現(xiàn),與siNotch1單獨作用組比較,SNAIL1下調(diào)程度無顯著差異,E-cadherin蛋白發(fā)生了顯著的表達上調(diào)。IL-24和siNotchl聯(lián)合作用通過抑制Notch信號通路(下調(diào)Notchl),抑制了EMT的發(fā)生,從而抑制肝癌細胞侵襲遷移的過程。該過程的通路和信號分子的變化與IL-24/GSI-I聯(lián)合作用后的效果較為相似。3.IL-24或siNotchl單獨作用組都有Caspase-3/7活性的增強,IL-24/siNotchl聯(lián)合作用組Caspase-3/7活性較對照組和單獨作用組都有顯著的增強,聯(lián)合組的酶活力單位是對照組的約5倍,是單獨作用組的約2-3倍。IL-24或siNotch1單獨作用都能誘導(dǎo)一定程度的早期凋亡,但是聯(lián)合作用組的凋亡現(xiàn)象更為顯著。結(jié)論1.IL-24雖然自身沒有抑制肝癌細胞侵襲的作用,但是能夠顯著增強siNotch1對肝癌侵襲的抑制作用,發(fā)揮了協(xié)同抑制效應(yīng),這種作用是通過顯著上調(diào)E-cadherin以及下調(diào)MMP-2實現(xiàn)的。2.IL-24和siNotchl聯(lián)合作用有明顯的誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡的作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7

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本文編號：2257156