【摘要】：原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC,以下簡稱肝癌)是臨床常見的消化道惡性腫瘤,發(fā)病率居惡性腫瘤第5位,死亡率位居第3位。除了外科手術(shù),肝癌患者還依賴全身化療、介入及局部放療,控制疾病進(jìn)程及提高5年生存率。該病高死亡率與肝癌細(xì)胞高度侵襲和高度轉(zhuǎn)移的生物學(xué)特征密切相關(guān)。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition,EMT)是指上皮細(xì)胞在某些特殊的生理或病理?xiàng)l件下失去極性,轉(zhuǎn)變?yōu)槟茉诩?xì)胞基質(zhì)自由移動、具有遷移能力的間質(zhì)細(xì)胞。研究表明,EMT是包括肝癌在內(nèi)的多種上皮細(xì)胞來源的惡性腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的生物學(xué)基礎(chǔ)。大多數(shù)實(shí)體腫瘤常常表現(xiàn)為局部缺氧狀態(tài)。缺氧微環(huán)境是腫瘤細(xì)胞對化療、放療產(chǎn)生耐受性的重要原因,也是促進(jìn)多種腫瘤發(fā)生早期侵襲轉(zhuǎn)移的重要因素。在缺氧微環(huán)境下,缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)被激活,與下游靶基因啟動子區(qū)域的缺氧反應(yīng)元件結(jié)合,參與轉(zhuǎn)移級聯(lián)反應(yīng),發(fā)揮促進(jìn)腫瘤增殖、發(fā)生EMT、誘導(dǎo)新生血管形成等功能。因此,開發(fā)能夠抑制腫瘤缺氧微環(huán)境相關(guān)因子的抗腫瘤藥物,對改善肝癌患者的預(yù)后具有重要的意義。中草藥南蛇藤(Celastrusorbiculatus Thunb.)為衛(wèi)矛科南蛇藤屬落葉木質(zhì)藤本植物,在我國已有幾千年的應(yīng)用歷史,具有散血通經(jīng)、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕以及消炎解毒的功效。課題組前期體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),南蛇藤莖乙酸乙酯提取物(C.orbiculatus ethyl acetate extract,COE)對腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移、凋亡及血管生成等方面具有顯著的抑制作用,但其對缺氧微環(huán)境下腫瘤細(xì)胞的作用尚不清楚。本課題首先利用CoCl2化學(xué)誘導(dǎo)法,建立人肝癌HepG2細(xì)胞穩(wěn)定的缺氧微環(huán)境。以不同濃度的COE干預(yù),研究缺氧微環(huán)境下,藥物對人肝癌HepG2細(xì)胞EMT的影響及其作用機(jī)制。本課題的研究,可為研發(fā)新型抗肝癌藥物提供充分的理論依據(jù)。本課題共分為三部分研究內(nèi)容。第一部分缺氧微環(huán)境對人肝癌HepG2細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響目的:CoCl2化學(xué)誘導(dǎo)法建立人肝癌HepG2細(xì)胞穩(wěn)定的缺氧微環(huán)境。觀察缺氧微環(huán)境對人肝癌HepG2細(xì)胞發(fā)生EMT的影響。方法:對數(shù)期人肝癌HepG2細(xì)胞,以不同濃度(50,100,200,400,800 μmol/L)的CoCl2誘導(dǎo)24 h,MTT法檢測CoCl2對人肝癌HepG2細(xì)胞增殖的影響,確定建立穩(wěn)定的缺氧微環(huán)境細(xì)胞模型時CoCl2的濃度。100 μmol/L的CoCl2作用于人肝癌HepG2細(xì)胞24 h后,觀察細(xì)胞的形態(tài)變化,并分別以Westernblot和細(xì)胞免疫熒光法檢測HIF-1α及EMT相關(guān)蛋白(E-cadherin、N-cadherin、Vimentin)的表達(dá)情況。結(jié)果:不同濃度(50,100,200,400,800 μmol/L)的CoCl2作用人肝癌HepG2細(xì)胞24h后,細(xì)胞生長受到不同程度的抑制。當(dāng)CoCl2濃度≤100μmol/L時,對細(xì)胞增殖無顯著影響(P0.05)。根據(jù)CoCl2對人肝癌HepG2細(xì)胞的抑制率,計算CoCl2的半數(shù)抑制濃度為(half maximal inhibitory concentration,IC50)為 468.4μmol/L,并確定后續(xù)實(shí)驗(yàn) CoCl2的誘導(dǎo)濃度為100 μmol/L。100 μmol/L濃度的CoCl2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞24 h后,與野生型細(xì)胞相比,細(xì)胞形態(tài)發(fā)生紡錘樣改變。Westernblot和細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)均表明,細(xì)胞E-cadherin蛋白的表達(dá)水平下降(P0.01);HIF-1α,N-cadherin 和 Vimentin 的蛋白表達(dá)水平上升(P0.01)。結(jié)論:100 μmol/L的CoCl2誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞24 h,成功建立穩(wěn)定的缺氧微環(huán)境。缺氧微環(huán)境下,人肝癌HepG2細(xì)胞更易發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。第二部分南蛇藤提取物對缺氧微環(huán)境下人肝癌HepG2細(xì)胞的影響目的:研究缺氧微環(huán)境下,不同濃度的南蛇藤提取物(COE)對人肝癌HepG2細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移及EMT的影響。方法:對數(shù)期人肝癌HepG2細(xì)胞,經(jīng)100 μmol/L的CoCl2誘導(dǎo)后,加入不同濃度(80,160,240,320,400 μg/mL)的COE,作用24h,MTT法檢測各藥物濃度對HepG2細(xì)胞增殖能力的影響,計算IC50,確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)的COE作用濃度。不同濃度(160,200,240 μg/mL)的COE及陽性對照藥物順鉑(DDP,2μg/mL),作用于缺氧微環(huán)境下的HepG2細(xì)胞24h后,流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況;線粒體膜電位(JC-1)檢測細(xì)胞凋亡途徑;細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞傷口愈合能力;Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的改變;Western blot和細(xì)胞免疫熒光法檢測EMT相關(guān)蛋白(E-cadherin、N-cadherin、Vimentin)的表達(dá)情況。結(jié)果:不同濃度(80,160,240,320,400μg/mL)的COE,作用缺氧微環(huán)境下的HepG2細(xì)胞24 h后,細(xì)胞的增殖被抑制,并呈一定的時間及濃度依賴性;根據(jù)COE對人肝癌HepG2細(xì)胞的抑制率,計算出COE作用24 h,對人肝癌HepG2細(xì)胞的IC50為316.5μg/mL。當(dāng)COE濃度80μg/mL時,對細(xì)胞的增殖無影響(P0.05)。不同濃度(160,200,240 μg/mL)的COE,作用HepG2細(xì)胞24h后,隨著COE濃度的增加,細(xì)胞晚期凋亡率逐漸增加,線粒體膜電位逐漸降低;細(xì)胞的傷口愈合、侵襲和轉(zhuǎn)移能力逐漸降低。Westemblot和細(xì)胞免疫熒光檢測結(jié)果表明,細(xì)胞E-cadherin蛋白的表達(dá)量逐漸增多(P0.01),N-cadherin和Vimentin的蛋白表達(dá)量逐漸降低(P0.01)。結(jié)論:COE抑制了缺氧微環(huán)境下人肝癌HepG2細(xì)胞的增殖;COE通過線粒體途徑促進(jìn)了 HepG2細(xì)胞的凋亡;COE能夠不同程度的抑制HepG2細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移及EMT的發(fā)生。第三部分南蛇藤提取物抑制缺氧微環(huán)境下人肝癌HeG2細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制目的:探討缺氧微環(huán)境下,南蛇藤提取物(COE)抑制人肝癌HepG2細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用機(jī)制。方法:對數(shù)期人肝癌HepG2細(xì)胞,經(jīng)100μmol/L的CoCl2誘導(dǎo)后,加入不同濃度(160,200,240 μg/mL)的 COE 作用 24 h,Western blot 檢測細(xì)胞中 HIF-1α/Twist1 信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的變化。加入HIF-1α蛋白抑制劑YC-1后,Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測COE(200 μg/mL)對HepG2細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響。Westernblot及細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn),檢測HepG2細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白(E-cadherin、N-cadherin、Vimentin)及HIF-1α/Twist1信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果:缺氧微環(huán)境下,不同濃度(160,200,240 μg/mL)的COE作用24h后,HIF-1α、Twist1蛋白的表達(dá)量降低,呈濃度依賴性(P0.05)。與對照組相比,YC-1組的細(xì)胞侵襲遷移能力下降(P0.01);E-cadherin蛋白的表達(dá)量增加(P0.05),HIF-1α、Twist1、Vimentin 和 N-cadherin 蛋白的表達(dá)量降低(P0.01)。同時,與對照組相比,COE(200μg/mL)聯(lián)合YC-1組,抑制細(xì)胞侵襲遷移的能力最強(qiáng)(P0.01),E-cadherin 蛋白的表達(dá)量最高(P0.01),HIF-1α、Twist1、Vimentin 和N-cadherin蛋白的表達(dá)量最低(P0.01)。結(jié)論:缺氧微環(huán)境下,COE抑制人肝癌HepG2細(xì)胞的EMT過程,其分子機(jī)制可能與HIF-1α/Twist1信號通路相關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R735.7

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