【摘要】：原發(fā)性肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC,以下簡稱肝癌)是臨床常見的消化道惡性腫瘤,發(fā)病率居惡性腫瘤第5位,死亡率位居第3位。除了外科手術,肝癌患者還依賴全身化療、介入及局部放療,控制疾病進程及提高5年生存率。該病高死亡率與肝癌細胞高度侵襲和高度轉移的生物學特征密切相關。上皮間質轉化(epithelial mesenchymal transition,EMT)是指上皮細胞在某些特殊的生理或病理條件下失去極性,轉變?yōu)槟茉诩毎|自由移動、具有遷移能力的間質細胞。研究表明,EMT是包括肝癌在內的多種上皮細胞來源的惡性腫瘤發(fā)生侵襲轉移的生物學基礎。大多數(shù)實體腫瘤常常表現(xiàn)為局部缺氧狀態(tài)。缺氧微環(huán)境是腫瘤細胞對化療、放療產(chǎn)生耐受性的重要原因,也是促進多種腫瘤發(fā)生早期侵襲轉移的重要因素。在缺氧微環(huán)境下,缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)被激活,與下游靶基因啟動子區(qū)域的缺氧反應元件結合,參與轉移級聯(lián)反應,發(fā)揮促進腫瘤增殖、發(fā)生EMT、誘導新生血管形成等功能。因此,開發(fā)能夠抑制腫瘤缺氧微環(huán)境相關因子的抗腫瘤藥物,對改善肝癌患者的預后具有重要的意義。中草藥南蛇藤(Celastrusorbiculatus Thunb.)為衛(wèi)矛科南蛇藤屬落葉木質藤本植物,在我國已有幾千年的應用歷史,具有散血通經(jīng)、強筋骨、祛風濕以及消炎解毒的功效。課題組前期體內外實驗研究發(fā)現(xiàn),南蛇藤莖乙酸乙酯提取物(C.orbiculatus ethyl acetate extract,COE)對腫瘤細胞的增殖、侵襲轉移、凋亡及血管生成等方面具有顯著的抑制作用,但其對缺氧微環(huán)境下腫瘤細胞的作用尚不清楚。本課題首先利用CoCl2化學誘導法,建立人肝癌HepG2細胞穩(wěn)定的缺氧微環(huán)境。以不同濃度的COE干預,研究缺氧微環(huán)境下,藥物對人肝癌HepG2細胞EMT的影響及其作用機制。本課題的研究,可為研發(fā)新型抗肝癌藥物提供充分的理論依據(jù)。本課題共分為三部分研究內容。第一部分缺氧微環(huán)境對人肝癌HepG2細胞上皮間質轉化的影響目的:CoCl2化學誘導法建立人肝癌HepG2細胞穩(wěn)定的缺氧微環(huán)境。觀察缺氧微環(huán)境對人肝癌HepG2細胞發(fā)生EMT的影響。方法:對數(shù)期人肝癌HepG2細胞,以不同濃度(50,100,200,400,800 μmol/L)的CoCl2誘導24 h,MTT法檢測CoCl2對人肝癌HepG2細胞增殖的影響,確定建立穩(wěn)定的缺氧微環(huán)境細胞模型時CoCl2的濃度。100 μmol/L的CoCl2作用于人肝癌HepG2細胞24 h后,觀察細胞的形態(tài)變化,并分別以Westernblot和細胞免疫熒光法檢測HIF-1α及EMT相關蛋白(E-cadherin、N-cadherin、Vimentin)的表達情況。結果:不同濃度(50,100,200,400,800 μmol/L)的CoCl2作用人肝癌HepG2細胞24h后,細胞生長受到不同程度的抑制。當CoCl2濃度≤100μmol/L時,對細胞增殖無顯著影響(P0.05)。根據(jù)CoCl2對人肝癌HepG2細胞的抑制率,計算CoCl2的半數(shù)抑制濃度為(half maximal inhibitory concentration,IC50)為 468.4μmol/L,并確定后續(xù)實驗 CoCl2的誘導濃度為100 μmol/L。100 μmol/L濃度的CoCl2誘導HepG2細胞24 h后,與野生型細胞相比,細胞形態(tài)發(fā)生紡錘樣改變。Westernblot和細胞免疫熒光實驗均表明,細胞E-cadherin蛋白的表達水平下降(P0.01);HIF-1α,N-cadherin 和 Vimentin 的蛋白表達水平上升(P0.01)。結論:100 μmol/L的CoCl2誘導人肝癌HepG2細胞24 h,成功建立穩(wěn)定的缺氧微環(huán)境。缺氧微環(huán)境下,人肝癌HepG2細胞更易發(fā)生上皮間質轉化。第二部分南蛇藤提取物對缺氧微環(huán)境下人肝癌HepG2細胞的影響目的:研究缺氧微環(huán)境下,不同濃度的南蛇藤提取物(COE)對人肝癌HepG2細胞增殖、侵襲轉移及EMT的影響。方法:對數(shù)期人肝癌HepG2細胞,經(jīng)100 μmol/L的CoCl2誘導后,加入不同濃度(80,160,240,320,400 μg/mL)的COE,作用24h,MTT法檢測各藥物濃度對HepG2細胞增殖能力的影響,計算IC50,確定后續(xù)實驗的COE作用濃度。不同濃度(160,200,240 μg/mL)的COE及陽性對照藥物順鉑(DDP,2μg/mL),作用于缺氧微環(huán)境下的HepG2細胞24h后,流式細胞術檢測細胞凋亡情況;線粒體膜電位(JC-1)檢測細胞凋亡途徑;細胞劃痕實驗檢測細胞傷口愈合能力;Transwell小室實驗檢測細胞侵襲轉移能力的改變;Western blot和細胞免疫熒光法檢測EMT相關蛋白(E-cadherin、N-cadherin、Vimentin)的表達情況。結果:不同濃度(80,160,240,320,400μg/mL)的COE,作用缺氧微環(huán)境下的HepG2細胞24 h后,細胞的增殖被抑制,并呈一定的時間及濃度依賴性;根據(jù)COE對人肝癌HepG2細胞的抑制率,計算出COE作用24 h,對人肝癌HepG2細胞的IC50為316.5μg/mL。當COE濃度80μg/mL時,對細胞的增殖無影響(P0.05)。不同濃度(160,200,240 μg/mL)的COE,作用HepG2細胞24h后,隨著COE濃度的增加,細胞晚期凋亡率逐漸增加,線粒體膜電位逐漸降低;細胞的傷口愈合、侵襲和轉移能力逐漸降低。Westemblot和細胞免疫熒光檢測結果表明,細胞E-cadherin蛋白的表達量逐漸增多(P0.01),N-cadherin和Vimentin的蛋白表達量逐漸降低(P0.01)。結論:COE抑制了缺氧微環(huán)境下人肝癌HepG2細胞的增殖;COE通過線粒體途徑促進了 HepG2細胞的凋亡;COE能夠不同程度的抑制HepG2細胞侵襲和轉移及EMT的發(fā)生。第三部分南蛇藤提取物抑制缺氧微環(huán)境下人肝癌HeG2細胞上皮間質轉化的分子機制目的:探討缺氧微環(huán)境下,南蛇藤提取物(COE)抑制人肝癌HepG2細胞上皮間質轉化的作用機制。方法:對數(shù)期人肝癌HepG2細胞,經(jīng)100μmol/L的CoCl2誘導后,加入不同濃度(160,200,240 μg/mL)的 COE 作用 24 h,Western blot 檢測細胞中 HIF-1α/Twist1 信號通路相關蛋白表達水平的變化。加入HIF-1α蛋白抑制劑YC-1后,Transwell小室實驗檢測COE(200 μg/mL)對HepG2細胞侵襲、轉移能力的影響。Westernblot及細胞免疫熒光實驗,檢測HepG2細胞EMT相關蛋白(E-cadherin、N-cadherin、Vimentin)及HIF-1α/Twist1信號通路相關蛋白的表達水平。結果:缺氧微環(huán)境下,不同濃度(160,200,240 μg/mL)的COE作用24h后,HIF-1α、Twist1蛋白的表達量降低,呈濃度依賴性(P0.05)。與對照組相比,YC-1組的細胞侵襲遷移能力下降(P0.01);E-cadherin蛋白的表達量增加(P0.05),HIF-1α、Twist1、Vimentin 和 N-cadherin 蛋白的表達量降低(P0.01)。同時,與對照組相比,COE(200μg/mL)聯(lián)合YC-1組,抑制細胞侵襲遷移的能力最強(P0.01),E-cadherin 蛋白的表達量最高(P0.01),HIF-1α、Twist1、Vimentin 和N-cadherin蛋白的表達量最低(P0.01)。結論:缺氧微環(huán)境下,COE抑制人肝癌HepG2細胞的EMT過程,其分子機制可能與HIF-1α/Twist1信號通路相關。
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【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R735.7

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本文編號：2254354