【摘要】：第一部分基于RNA-seq技術(shù)的宮頸鱗癌和癌旁組織的差異表達基因分析目的：宮頸癌是婦科最常見的惡性腫瘤之一,居女性癌癥患者死亡原因的第4位。除HPV感染外,被感染細胞的基因組異常才能最終導致宮頸癌的發(fā)生發(fā)展,因此與細胞生長分化相關的基因表達調(diào)控異常在宮頸癌的發(fā)病機制中同樣具有重要作用。轉(zhuǎn)錄組是基因功能及結(jié)構(gòu)研究的基礎和出發(fā)點。本研究擬應用RNA-seq技術(shù)全面分析宮頸鱗癌組織和癌旁組織的轉(zhuǎn)錄組,篩選出差異表達基因,進而分析差異表達基因的相互作用、涉及的信號通路、以及差異表達基因與宮頸鱗癌臨床病理因素的相關性,尋找可能的宮頸鱗癌診斷的分子標記物和靶向治療目標,為宮頸癌的診治提供實驗依據(jù)和理論基礎。方法：構(gòu)建cDNA文庫后,應用RNA-seq全面分析3對宮頸鱗癌和對應癌旁組織的轉(zhuǎn)錄組,篩選出宮頸鱗癌組織和癌旁組織的差異表達基因。應用GO(Gene Ontology)方法分析差異表達基因的功能聚類,應用KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)信號通路富集性方法分析差異表達基因相關的信號通路。構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡,分析差異表達基因之間的相互作用,篩選出重要的差異表達基因。應用實時熒光定量PCR和免疫組化的方法驗證宮頸鱗癌組織和癌旁組織的差異基因的表達水平,并分析差異基因與宮頸鱗癌臨床病理因素的相關性。結(jié)果：3對宮頸鱗癌組織和癌旁組織共有347個差異表達基因,包括104個表達一致上調(diào)的基因、148個表達一致下調(diào)的基因。347個差異表達基因被分為73個功能聚類,104個表達一致上調(diào)的差異表達基因被分為34個功能聚類,148個表達一致下調(diào)的差異表達基因被分為80個功能聚類。通過KEGG信號通路富集性分析,我們發(fā)現(xiàn)差異表達基因富集到6條信號通路上,包括細胞因子-細胞因子受體相互作用信號通路、補體系統(tǒng)及凝血相關信號通路、視黃醇代謝相關信號通路、趨化因子相關信號通路、細胞色素p450外源性物質(zhì)代謝相關信號通路、黑素原生成相關信號通路。蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡分析發(fā)現(xiàn)三個重要的差異表達基因,為RDH12,UBD, SAA1。與癌旁組織相比,RDH12基因在74.5%的宮頸鱗癌組織中表達下降,與腫瘤直徑及宮頸肌層浸潤深度負相關。UBD基因在61.7%的宮頸鱗癌組織中表達升高,與腫瘤直徑及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移正相關。SAA1基因在57.4%的宮頸鱗癌組織中表達升高,與腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、宮頸肌層浸潤深度正相關。結(jié)論：本研究首次利用RNA-seq技術(shù)對宮頸鱗癌和癌旁組織中的差異表達基因進行了全面分析,發(fā)現(xiàn)宮頸鱗癌與癌旁組織中共有347個差異表達基因,富集到6個信號通路上,其中差異表達基因RDH12, UBD, SAA1與宮頸鱗癌臨床病理因素相關,可能成為宮頸癌診斷和治療的靶基因,但其在宮頸鱗癌發(fā)生發(fā)展中的機制仍需進一步研究。第二部分基于RNA-seq技術(shù)的宮頸鱗癌與癌旁組織的可變剪接分析目的：前體mRNA的可變剪接是真核生物蛋白質(zhì)多樣性的重要調(diào)控機制。mRNA異常剪接與腫瘤發(fā)生關系密切,涉及細胞周期、代謝、及信號轉(zhuǎn)導調(diào)控�？勺兗艚釉趯m頸鱗癌中的作用機制尚不清楚。本研究擬應用RNA-seq技術(shù)全面分析宮頸鱗癌組織和癌旁組織中的可變剪接事件、可變剪接基因、可變剪接涉及的信號通路、可變剪接基因與宮頸鱗癌臨床病理因素的相關性,為宮頸癌的診治提供新的思路。方法：用RNA-seq技術(shù)分析4對宮頸鱗癌和癌旁組織的轉(zhuǎn)錄本信息,用SpliceMap軟件檢測宮頸鱗癌組織和癌旁組織的可變剪接事件,使用Bowt ie軟件將每個檢測片段與人類基因組進行比對,篩選出宮頸鱗癌特異性的可變剪接事件。應用KEGG信號通路顯著性富集方法分析可變剪接事件參與的信號轉(zhuǎn)導通路。根據(jù)4個宮頸鱗癌組織中的可變剪接事件mapped reads的數(shù)目,挑選出KLHDC7B和SYCP2基因,并用RT-PCR方法驗證可變剪接基因KLHDC7B和口SYCP2在宮頸鱗癌組織中的表達水平,并分析可變剪接基因與宮頸鱗癌臨床病理因素的相關性。結(jié)果：根據(jù)RNA-seq數(shù)據(jù),4個宮頸鱗癌組織中共有35個特異性的可變剪接基因。KEGG信號通路富集性分析表明宮頸鱗癌特異性的可變剪接事件富集到16條信號通路上,包括代謝相關信號通路、細胞內(nèi)吞作用相關信號通路、ras信號通路等。KLHDC7B基因存在可變5’剪接位點,該基因在66.0%的宮頸鱗癌組織中表達升高,與腫瘤直徑正相關。SYCP2基因存在外顯子跳躍,該基因在38.2%的宮頸鱗癌組織中表達升高,與宮頸肌層浸潤深度正相關。結(jié)論：本研究首次利用RNA-seq技術(shù)對宮頸鱗癌和癌旁組織轉(zhuǎn)錄本中的可變剪接事件進行了全面分析,發(fā)現(xiàn)宮頸鱗癌中的可變剪接事件富集到16條信號通路上,篩選出宮頸鱗癌特異性的可變剪接基因共35個,其中可變剪接基因KLHDC7B和SYCP2與宮頸鱗癌臨床病理因素相關,可能成為宮頸癌診斷的分子標記物和治療的靶點,但其在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制仍需進一步研究。
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【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R737.33

【參考文獻】

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1 Patrick M.Glassman;Joseph P.Balthasar;;Mechanistic considerations for the use of monoclonal antibodies for cancer therapy[J];Cancer Biology & Medicine;2014年01期

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本文編號：2253018