【摘要】：第一部分全基因表達(dá)譜技術(shù)篩選與Wnt通路相關(guān)的NSCLC轉(zhuǎn)移相關(guān)性基因目的：本研究旨在運(yùn)用全基因表達(dá)譜技術(shù)初步篩選NSCLC轉(zhuǎn)移差異表達(dá)基因,尋找與Wnt通路相關(guān)的轉(zhuǎn)移基因并分析其基因功能,為非小細(xì)胞肺癌的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移機(jī)制研究及治療位點(diǎn)提供新思路。方法：收集2014年4月至2014年10月山東大學(xué)齊魯醫(yī)院胸外科手術(shù)切取的肺癌組織,離體后立即放入凍存管中,并于10分鐘內(nèi)置于液氮罐中冷凍2-3小時(shí),后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱中凍存。同時(shí)收集留取標(biāo)本肺癌患者的臨床資料。所選病例均未行術(shù)前放療和化療,且經(jīng)病理證實(shí)為原發(fā)性非小細(xì)胞肺癌。從中選取淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組6例,為實(shí)驗(yàn)組,無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組6例,為對(duì)照組。Trizol法抽提RNA,使用NanoDrop ND-1000評(píng)估RNA量和質(zhì)量,RNA完整性通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)變性凝膠電泳進(jìn)行評(píng)估。采用Agilent人類4×44K基因表達(dá)微陣列v2,將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組進(jìn)行全基因組表達(dá)譜實(shí)驗(yàn)。使用Agilent Feature Extraction軟件獲得芯片圖,得到原始數(shù)據(jù)。使用GeneSpring GX v12.1軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行Quantile標(biāo)準(zhǔn)化,并進(jìn)行基因本體論(Gene Ontology, GO)分析和Pathway分析,篩選與Wnt通路相關(guān)的轉(zhuǎn)移差異基因并分析其可能參與的生物學(xué)過(guò)程。結(jié)果：1、RNA質(zhì)量控制：基因芯片實(shí)驗(yàn)樣本的OD值顯示A260/A280均在1.8-2.1之間,瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示28SrRNA和18SrRNA條帶清晰,RNA純度和完整性較好,樣品合格。2、聚類分析：聚類分析顯示轉(zhuǎn)移組和非轉(zhuǎn)移組組間差異顯著,同一類樣品能通過(guò)聚類出現(xiàn)在同一個(gè)簇(cluster)中,聚在同一個(gè)簇的樣品具有相似的生物學(xué)性質(zhì),提示芯片試驗(yàn)具有一定的重復(fù)性,結(jié)果可靠。3、差異基因：根據(jù)倍數(shù)法篩選出差異基因11975個(gè),轉(zhuǎn)移上調(diào)基因5812個(gè),下調(diào)基因6163個(gè)。4、GO分析：結(jié)果顯示差異基因主要涉及多細(xì)胞生物過(guò)程、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、G蛋白偶聯(lián)受體活性、細(xì)胞外基質(zhì)等功能集團(tuán)。5、Pathway分析：轉(zhuǎn)移相關(guān)差異基因主要涉及MAPK信號(hào)通路、細(xì)胞周期、PI3K-Akt信號(hào)通路、Wnt通路、p53信號(hào)通路等。6、篩選Wnt通路差異基因：篩選出與Wnt通路相關(guān)的NSCLC轉(zhuǎn)移差異基因共34個(gè),其中上調(diào)基因18個(gè),下調(diào)基因16個(gè),涉及細(xì)胞周期素基因、蛋白激酶C基因、卷曲家族受體基因、轉(zhuǎn)錄因子基因等,GO分析顯示上述基因參與蛋白結(jié)合、細(xì)胞質(zhì)膜、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、卷曲蛋白結(jié)合、細(xì)胞增殖正性調(diào)節(jié)、特定序列DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性等生物學(xué)過(guò)程。結(jié)論：1、NSCLC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與未轉(zhuǎn)移之間存在大量差異表達(dá)基因,涉及多種細(xì)胞生物過(guò)程、細(xì)胞外基質(zhì)等功能集團(tuán)和MAPK、Wnt、p53等多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。2、與Wnt通路相關(guān)的差異基因主要參與特定序列DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖正性調(diào)節(jié)等生物學(xué)過(guò)程,但尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。第二部分與Wnt通路相關(guān)的非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的驗(yàn)證目的：由于芯片結(jié)果存在一定的假陽(yáng)性率,本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)技術(shù)對(duì)目的基因進(jìn)行相對(duì)定量檢測(cè)與分析,旨在驗(yàn)證表達(dá)譜芯片的可靠性,指導(dǎo)下一步研究方向。方法：從上述篩選出的34個(gè)差異基因中挑選出與腫瘤發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系的基因CCND2, PRKCA, NFATC1作為目的基因,繼續(xù)應(yīng)用上述12例肺癌凍存組織,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組6例,為實(shí)驗(yàn)組,無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組6例,為對(duì)照組。RNA抽提方法及質(zhì)量檢測(cè)方法同上,分別對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的目的基因及管家基因進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù),并繪制濃度稀釋DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算目的基因相對(duì)含量,采用配對(duì)t檢驗(yàn)檢測(cè)實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果與基因芯片結(jié)果是否具有一致性。結(jié)果：所選取的差異基因CCND2, PRKCA, NFATC1在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中較無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組均呈表達(dá)上調(diào),且實(shí)時(shí)定量PCR與表達(dá)譜芯片的上調(diào)倍數(shù)對(duì)比,二者差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.4539,P0.05)。結(jié)論：1、CCND2, PRKCA, NFATC1實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果與表達(dá)譜芯片結(jié)果一致,全基因表達(dá)譜芯片技術(shù)能夠高通量篩選出具有研究意義的差異表達(dá)基因。2、CCND2, PRKCA, NFATC1基因與人類腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),在肺癌轉(zhuǎn)移中表達(dá)水平上調(diào),表明其在肺癌侵襲轉(zhuǎn)移中具有重要研究?jī)r(jià)值。
[Abstract]:Part I Screening of NSCLC metastasis-related genes associated with Wnt pathway by whole gene expression profiling: The purpose of this study was to screen differentially expressed genes for NSCLC metastasis by using whole gene expression profiling technology, search for Wnt pathway-related metastasis genes and analyze their gene functions, and study the invasion and metastasis mechanism of non-small cell lung cancer. Methods: Lung cancer tissues were collected from the thoracic surgery of Qilu Hospital of Shandong University from April 2014 to October 2014. The tissues were put into cryopreservation tube immediately after being detached and frozen in liquid nitrogen tank for 2-3 hours within 10 minutes. Materials. None of the patients underwent preoperative radiotherapy or chemotherapy, and were confirmed to be primary non-small cell lung cancer by pathology. Six patients with lymph node metastasis were selected as experimental group, six patients without lymph node metastasis as control group. RNA was extracted by Trizol method, and RNA quantity and quality were evaluated by NanoDrop ND-1000. RNA integrity was evaluated by standard denaturing gel electrophoresis. Using Agilent human 4 *44K gene expression microarray v2, the whole genome expression profiles of the experimental group and the control group were tested. The chips were obtained by using Agilent Feature Extraction software, and the original data were obtained. The original data were standardized by using GeneSpring GX v12.1 software, and the gene ontology (GO) was performed. Results: 1. RNA quality control: OD values of DNA chip samples showed that A260/A280 were between 1.8 and 2.1. Agarose gel electrophoresis showed that 28SrRNA and 18SrRNA bands were clear, RNA purity and integrity were good. Cluster analysis: Cluster analysis showed that there was a significant difference between metastatic group and non-metastatic group. Samples of the same group could appear in the same cluster by clustering. Samples clustered in the same cluster had similar biological properties, suggesting that the chip test had a certain repeatability and the results were reliable. Methods 11975 differentially expressed genes, 5812 up-regulated genes and 6163 down-regulated genes were screened. GO analysis showed that the differentially expressed genes were mainly involved in multicellular biological processes, signal transduction, G protein-coupled receptor activity, extracellular matrix and other functional groups. Cycle, PI3K-Akt signaling pathway, Wnt pathway, p53 signaling pathway and so on. 6. Screening of Wnt pathway differential genes: Screening of Wnt pathway related to NSCLC transfer differential genes a total of 34, including 18 up-regulated genes, 16 down-regulated genes, involving cyclin genes, protein kinase C genes, convolution family receptor genes, transcription factor genes, GO analysis was obvious. These genes are involved in protein binding, cytoplasmic membrane, intracellular signal transduction, convolution protein binding, positive regulation of cell proliferation, and activity of specific DNA binding transcription factors. Functional groups, MAPK, Wnt, p53 and other signal transduction pathways. 2. Differential genes related to Wnt pathway are involved in specific sequence DNA binding transcription factor activity, intracellular signal transduction, positive regulation of cell proliferation and other biological processes, but need to be further verified. The second part is related to metastasis of non-small cell lung cancer associated with Wnt pathway. Objective: In order to verify the reliability of the microarray and guide the next research direction, real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) was used to detect and analyze the target gene. CCND2, PRKCA and NFATC1 were selected as the target genes from the 34 differentially expressed genes. The 12 cases of lung cancer cryopreserved tissues, 6 cases of lymph node metastasis group, 6 cases of experimental group and 6 cases of non-lymph node metastasis group were used as control group. RNA extraction method and quality detection method were the same. Real-time quantitative PCR was performed on the target genes and housekeeping genes of experimental group and control group respectively, and the concentration dilution DNA standard curve was drawn to calculate the relative content of the target genes. There was no significant difference between the two groups (t = 0.4539, P 0.05). Conclusion: 1. The results of CCND2, PRKCA, NFATC1 real-time quantitative PCR were consistent with those of expression microarray, and the whole gene expression microarray technology could achieve high throughput. The differentially expressed genes. 2, CCND2, PRKCA and NFATC1 are closely related to the occurrence and development of human tumors. They are up-regulated in the metastasis of lung cancer, indicating that they have important research value in the invasion and metastasis of lung cancer.
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R734.2

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10 王婷婷;細(xì)胞因子活化殺傷細(xì)胞治療非小細(xì)胞肺癌臨床研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

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本文編號(hào)：2239408