發(fā)布時間：2018-09-07 19:19

【摘要】：背景和目的食管癌(esophageal carcinoma,EC)是一種高度惡性的消化道腫瘤,有2種重要類型:食管腺癌(esophageal adenocarcinoma,EAC)和食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell cancer,ESCC),食管腺癌在西方國家比較多見,食管鱗狀細(xì)胞癌在發(fā)展中國家更流行。河南林州是食管癌的高發(fā)區(qū),占當(dāng)?shù)厝繍盒阅[瘤的81.4%。目前,外科手術(shù)治療是治療早期食管癌的首選方法,但很多中晚期患者確診時已失去手術(shù)治療的機(jī)會。因此,食管癌患者總的五年存活率很低。盡管多個遺傳和表觀遺傳變化已在食管鱗癌被發(fā)現(xiàn),但食管癌的確切發(fā)病機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。因此進(jìn)一步從分子水平研究食管癌的發(fā)生發(fā)展,有重要的現(xiàn)實意義和理論價值。長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA,lnc RNA)是一種長度大于200個核苷酸的非編碼RNA。在人體內(nèi),lnc RNA在基因內(nèi)的分布非常廣泛,雖然lnc RNA并不編碼蛋白質(zhì),但是其參與構(gòu)成復(fù)雜且非常重要的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò),從而巧妙地調(diào)節(jié)基因表達(dá)。近來研究結(jié)果顯示lnc RNAs在正常組織發(fā)育以及調(diào)控細(xì)胞多能性和細(xì)胞分化的過程中起重要作用。此外,lnc RNAs參與控制多種分子途徑,引起基因表達(dá)改變,最終調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡與細(xì)胞遷移。因此lnc RNAs的表達(dá)失調(diào)與人類多種疾病密切相關(guān),比如腫瘤形成。lnc RNA TP73-AS1定位于1p36.32,查閱國內(nèi)外文獻(xiàn)目前關(guān)于lnc RNATP73-AS1的報道非常少,僅Yu等的研究顯示對比正常肺組織,lnc RNATP73-AS1在非小細(xì)胞型肺癌中表達(dá)顯著下降;對比腺癌,小細(xì)胞肺癌和鱗癌,lnc RNATP73-AS1在大細(xì)胞肺癌中表達(dá)顯著升高,這項結(jié)果提示lnc RNATP73-AS1在腫瘤的發(fā)展進(jìn)程中可能扮演了重要角色。目前未發(fā)現(xiàn)lnc RNA TP73-AS1在食管癌中的相關(guān)報道。我們的研究第一次綜合分析了lnc RNATP73-AS1在食管癌中表達(dá)和生物學(xué)作用,并初步探討了其腫瘤調(diào)節(jié)作用的分子機(jī)制。本研究包括三部分:第一部分:食管鱗狀細(xì)胞癌組織中l(wèi)nc RNA異常表達(dá)及與臨床病理特征相關(guān)性分析;第二部分:調(diào)控lnc RNATP73-AS1表達(dá)對食管鱗癌細(xì)胞系EC9706和KYSE30增殖和凋亡的影響;第三部分:lnc RNATP73-AS1作用機(jī)制的初步研究。第一部分食管鱗狀細(xì)胞癌組織中l(wèi)nc RNA異常表達(dá)及與臨床病理特征相關(guān)性分析方法1.收集了60例食管鱗狀上皮細(xì)胞癌組織標(biāo)本,包括60例食管鱗狀上皮細(xì)胞癌組織和60例配對的癌旁正常組織標(biāo)本。2.運用lnc RNA基因芯片檢測食管鱗狀上皮細(xì)胞癌組織和配對的癌旁組織標(biāo)本中l(wèi)nc RNA的表達(dá)情況。3.運用q RT-PCR檢測60例標(biāo)本中4種lnc RNA(lnc RNA TP73-AS1、lnc RNA LOC345051、lnc RNA XLOC_008700和lnc RNA TMEM71)表達(dá)水平,驗證lnc RNA芯片結(jié)果的可靠性。4.依據(jù)lnc RNA TP73-AS1的表達(dá)水平,運用雙變量相關(guān)性分析其與食管癌病人年齡、性別、TNM分期、腫瘤分化及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的相關(guān)性。結(jié)果1.lnc RNA芯片檢測分析得到89個差異表達(dá)的lnc RNA,其中在食管鱗癌組織中上調(diào)的lnc RNA有29個(32.6%),下調(diào)的lnc RNA有60個(67.4%)。lnc RNA TP73-AS1在食管鱗狀上皮細(xì)胞癌組織中表達(dá)增高。2.q RT-PCR結(jié)果顯示在4種lnc RNA中,只有l(wèi)nc RNA TMEM71驗證結(jié)果和基因芯片結(jié)果不一致,其余3種lnc RNA用lnc RNA檢測芯片和q RT-PCR兩種方法得到的結(jié)果具有很好的一致性,證實了芯片數(shù)據(jù)的可靠性。3.雙變量相關(guān)性分析結(jié)果顯示lnc RNA TP73-AS1的表達(dá)水平與食管癌定位及TNM分期相關(guān)(P0.05),與病人的年齡、性別、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和分化程度無相關(guān)性(P0.05)。第二部分調(diào)控lnc RNA TP73-AS1表達(dá)對食管鱗癌細(xì)胞系EC9706和KYSE30增殖和凋亡的影響方法1.制備沉默lnc RNA TP73-AS1表達(dá)的重組慢病毒,感染對數(shù)生長期EC9706和KYSE30細(xì)胞,得到下調(diào)lnc RNA TP73-AS1表達(dá)的EC9706和KYSE30細(xì)胞株。2.CCK-8試劑和克隆形成實驗檢測下調(diào)lnc RNA TP73-AS1對EC9706和KYSE30細(xì)胞增殖能力的影響。3.Transwell實驗用來檢測下調(diào)lnc RNA TP73-AS1對EC9706和KYSE30細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。4.流式細(xì)胞術(shù)和Hoechst 33342染色檢測下調(diào)lnc RNA TP73-AS1對EC9706和KYSE30細(xì)胞凋亡的影響。5.裸鼠移植瘤實驗從體內(nèi)水平檢測調(diào)控lnc RNA TP73-AS1表達(dá)對食管癌的影響。結(jié)果1.對比空白對照組,轉(zhuǎn)染lnc RNA TP73-AS1 si RNA1組和lnc RNA TP73-AS1si RNA2組的lnc RNA TP73-AS1表達(dá)水平顯著下調(diào)(P0.01),得到下調(diào)lnc RNA TP73-AS1表達(dá)的EC9706和KYSE30細(xì)胞株。2.CCK8實驗結(jié)果顯示:與對照組比較,lnc RNA TP73-AS1 si RNA1組和lnc RNA TP73-AS1 si RNA2組EC9706和KYSE30細(xì)胞的生長在轉(zhuǎn)染24h后出現(xiàn)顯著抑制(P0.05),并且隨時間的延長而日益顯著。3.EC9706細(xì)胞克隆形成實驗結(jié)果顯示空白對照組,無關(guān)序列對照組,lnc RNA TP73-AS1 si RNA1組和lnc RNA TP73-AS1 si RNA2組克隆形成數(shù)分別為162.0±19.3;167.4±18.3;47.3±7.8和56.3±7.8。KYSE30細(xì)胞克隆形成實驗結(jié)果顯示空白對照組,無關(guān)序列對照組,lnc RNA TP73-AS1 si RNA1組和lnc RNA TP73-AS1 si RNA2組克隆形成數(shù)分別為155.0±17.2;159.2±18.6;43.5±7.5和49.5±7.5。說明下調(diào)食管癌細(xì)胞中l(wèi)nc RNA TP73-AS1表達(dá),EC9706和KYSE30細(xì)胞克隆數(shù)顯著減少(P0.05),其生長受到顯著抑制。4.Annexin V/Pl染色結(jié)果提示:lnc RNA TP73-AS1 si RNA1組和lnc RNA TP73-AS1 si RNA2組EC9706和KYSE30細(xì)胞凋亡率與si RNA無關(guān)序列和空白對照組對照組相比顯著升高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。5.EC9706細(xì)胞Hoechst 33342染色實驗結(jié)果顯示空白對照組、si RNA無關(guān)序列對照組細(xì)胞的凋亡率分別為(5.21±0.61)%和(5.42±0.72)%;lnc RNA TP73-AS1si RNA1組和lnc RNA TP73-AS1 si RNA2組細(xì)胞凋亡率為(20.72±3.28)%和(18.70±3.10)%,與空白對照組、si RNA無關(guān)序列對照組細(xì)胞的凋亡數(shù)比較顯著升高,差異均有顯著性(P0.05)。KYSE30細(xì)胞實驗結(jié)果顯示空白對照組、si RNA無關(guān)序列對照組細(xì)胞的凋亡率分別為(6.12±0.75)%和(5.80±0.65)%;lnc RNA TP73-AS1 si RNA1組和lnc RNA TP73-AS1 si RNA2組細(xì)胞凋亡率為(23.36±4.23)%和(24.20±4.30)%,相比空白對照組和si RNA無關(guān)序列對照組,細(xì)胞的凋亡數(shù)顯著升高,差異有顯著性(P0.05)。6.Transwell侵襲實驗結(jié)果顯示lnc RNA TP73-AS1 si RNA1組和lnc RNA TP73-AS1 si RNA2組細(xì)胞侵襲數(shù)與空白對照組和si RNA無關(guān)序列對照組相比差異無顯著性(P0.05)。7.裸鼠移植瘤體內(nèi)實驗結(jié)果顯示對比空白對照組和si RNA無關(guān)序列對照組,lnc RNA TP73-AS1 si RNA組移植瘤顯著減小,熒光信號值也顯著降低(P0.05)。第三部分lnc RNA TP73-AS1作用機(jī)制的初步研究方法1.采用m RNA芯片檢測下調(diào)lnc RNA TP73-AS1表達(dá)和無關(guān)序列對照si RNA的EC9706和KYSE30細(xì)胞的m RNA表達(dá)譜。2.分析芯片結(jié)果,使用q RT PCR和Western-blot檢測下調(diào)lnc RNA TP73-AS1表達(dá)EC9706和KYSE30細(xì)胞中的BDH2的表達(dá)水平。3.制備沉默BDH2表達(dá)的EC9706和KYSE30細(xì)胞。CCK-8試劑盒、Hoechst33342染色和Western Blot檢測下調(diào)BDH2對食管癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響。4.q RT-PCR檢測60例食管癌標(biāo)本和對應(yīng)癌旁組織中BDH2 m RNA表達(dá)情況并與臨床病理特征和lnc RNA TP73-AS1進(jìn)行相關(guān)性分析。5.構(gòu)建lnc RNA TP73-AS1野生型和突變型載體,q RT PCR檢測野生型和突變型lnc RNA TP73-AS1對EC9706和KYSE30細(xì)胞株中mi R-141-3p表達(dá)的影響。6.雙熒光素酶報告實驗驗證BDH2是mi R-141-3p的靶基因。7.克隆形成實驗和流式細(xì)胞儀檢測上調(diào)mi R-141-3p表達(dá)對食管癌細(xì)胞生長和凋亡的影響。結(jié)果1.m RNA芯片分析結(jié)果顯示:對比轉(zhuǎn)染無關(guān)序列si RNA對照組的EC9706和KYSE30細(xì)胞,轉(zhuǎn)染lnc RNA TP73-AS1 si RNA食管癌細(xì)胞中BDH2的含量顯著降低。2.q RT-PCR和Western-blot結(jié)果顯示對比空白對照和無關(guān)序列對照組,下調(diào)食管鱗癌細(xì)胞EC9706和KYSE30中l(wèi)nc RNA TP73-AS1的表達(dá)顯著抑制了BDH2 m RNA和蛋白的表達(dá)(P0.05)。3.對比空白對照和無關(guān)序列對照組,EC9706和KYSE30細(xì)胞轉(zhuǎn)染入BDH2si RNA1和BDH2 si RNA2后,BDH2表達(dá)均顯著下降(P0.05)。4.CCK8結(jié)果顯示,與對照組比較,BDH2 si RNA1組和BDH2 si RNA2組EC9706和KYSE30細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后24h后出現(xiàn)顯著生長抑制(P0.05),并且隨時間的延長而日益顯著。5.EC9706細(xì)胞Hoechst 33342染色實驗結(jié)果顯示空白對照組、si RNA無關(guān)序列對照組細(xì)胞的凋亡率分別為(4.22±0.45)%和(4.31±0.47)%;BDH2 si RNA1組和BDH2 si RNA2組細(xì)胞凋亡率為(17.70±1.80)%和(16.11±1.75)%,與si RNA無關(guān)序列對照組、空白對照組細(xì)胞的凋亡數(shù)相比顯著升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。KYSE30細(xì)胞實驗結(jié)果顯示空白對照組、si RNA無關(guān)序列對照組細(xì)胞的凋亡率分別為(5.23±0.45)%和(5.40±0.52)%;BDH2si RNA1組和BDH2 si RNA2組細(xì)胞凋亡率為(19.71±2.10)%和(17.20±1.80)%,相比空白對照組和si RNA無關(guān)序列對照組,細(xì)胞的凋亡數(shù)顯著升高,差異具有顯著性(P0.05)。6.對比空白對照組,轉(zhuǎn)染BDH2 si RNA1或lnc RNATP73-AS1 si RNA1后,EC9706和KYSE30細(xì)胞中BDH2表達(dá)顯著下降;cleaved caspase-3和cleaved caspase-9表達(dá)顯著升高;但是Bcl-2,Bax和pro-caspase-9的表達(dá)在三個實驗組之間無顯著差異。7.對比癌旁正常組織,食管癌組織中BDH2表達(dá)顯著升高(P0.05),經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析顯示食管癌組織中BDH2的表達(dá)水平與食管癌TNM分期密切相關(guān),與病人的年齡、性別、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度和腫瘤部位無相關(guān)性(P0.05)。食管癌組織中l(wèi)nc RNA TP73-AS1表達(dá)與BDH2 m RNA表達(dá)存在顯著正相關(guān)性(R2=0.619)8.生物信息學(xué)分析lnc RNA TP73-AS1和mi R-141-3p存在2個相互作用的seed region區(qū)特異結(jié)合位點,分別位于chr1:3655109-3655129[-]和chr1:3662504-3662525[-]。9.lnc RNA TP73-AS1通過與2個seed region區(qū)特異結(jié)合對EC9706和KYSE30細(xì)胞株中mi R-141-3p表達(dá)起負(fù)調(diào)控作用。10.BDH2是mi R-141-3p的靶基因。轉(zhuǎn)染mi R-141-3p mimics能抑制食管癌細(xì)胞生長,誘導(dǎo)其細(xì)胞凋亡,提示lnc RNA TP73-AS1通過作用于mi R-141-3p增加BDH2表達(dá),從而抑制食管癌細(xì)胞生長,促進(jìn)其凋亡。結(jié)論1.本研究篩選得到89個差異表達(dá)的lnc RNA基因,其中有29個(32.6%)上調(diào),60個(67.4%)下調(diào)。lnc RNA TP73-AS1和BDH2在食管鱗癌組織中異常高表達(dá),二者表達(dá)存在正相關(guān),且與TNM分期相關(guān)。2.下調(diào)食管鱗癌EC9706和KYSE30細(xì)胞中l(wèi)nc RNA TP73-AS1表達(dá)可有效抑制食管鱗癌EC9706和KYSE30細(xì)胞的增殖并且促進(jìn)細(xì)胞凋亡。3.lnc RNA TP73-AS1通過與2個seed region區(qū)特異結(jié)合負(fù)調(diào)控mi R-141-3p表達(dá);BDH2是mi R-141-3p的靶基因,mi R-141-3p通過與BDH2 3’UTR結(jié)合負(fù)調(diào)控其表達(dá)。食管鱗癌中l(wèi)nc RNA TP73-AS1對增殖和凋亡作用的機(jī)制可能部分是由于lnc RNA TP73-AS1通過調(diào)控mi R-141-3p表達(dá),進(jìn)而影響B(tài)DH2基因表達(dá),發(fā)揮其生物學(xué)作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.1
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本文編號：2229181